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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 透析 蛋白沉淀 复性
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jamy1989

木虫 (小有名气)

[求助] 透析 蛋白沉淀 复性

我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析复性，透析完后全部沉淀了，跑胶什么都没有！我透析的步骤是：
1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl   0.4M L-Arg    1mM EDTA   0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl   0.4M L-Arg    1mM EDTA   0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
3、binding buffer 20mM磷酸钠 500mM氯化钠 5mM咪唑 PH=7.6
虫友分析可能是透析蛋白浓度大，梯度变化太大了！于是我重新做了两个对比试验。这次透析的蛋白溶度被我降低了！并且每升只透析20ml，我做了个对比试验：
1号瓶分别用4M 尿素、 1M尿素、binding buffer 透析！
2号瓶分别用4M 尿素、 2M尿素、1M尿素、0M尿素、binding buffer 透析！
结果1号瓶还是在用binding buffer透析是全部出现沉淀，取沉淀跑胶，能看到目的条带！
2号瓶也是在用binding buffer 透析是全部出现沉淀（大约在透析3个小时的时候就有很多沉淀了），和1号瓶一样！另外当2号瓶透析到0M结束时我取了一些样保留下来，跑胶能看到目的条带！
我在想是不是binding buffer 有问题呢？我底下准备用His-tag纯化蛋白，是不是一定要用binding buffer 透析呢？
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qwdr
1楼 2012-04-30 22:17:02
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jamy1989

木虫 (小有名气)
顶一下！
2楼2012-05-06 21:56:50
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励交流~ 2012-05-09 09:18:29
jamy1989: 金币+5 2012-05-10 10:52:37
本帖内容被屏蔽
3楼2012-05-08 10:44:26
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-08 10:44:26:
我想问一下，你能否采用稀释复性后上柱？一定要用透析方法吗？我知道有得项目一般是变性以后直接稀释N倍，过夜低温复性，然后上柱分离层析，不知道你的产品是否可以这样做？

貌似不可以吧，我的是要除去尿素复性的！
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qwdr
4楼2012-05-08 21:03:05
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2012-05-09 12:14:28
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+5 2012-05-09 16:17:14
这么看是binding buffer 的可能性比较大啊。你可以透析到0M urea的时候就不透析了，改为desalting换buffer试试。
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6楼2012-05-09 12:50:28
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-09 12:50:28:
这么看是binding buffer 的可能性比较大啊。你可以透析到0M urea的时候就不透析了，改为desalting换buffer试试。

具体怎么做呢？
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qwdr
7楼2012-05-09 16:17:58
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by jamy1989 at 2012-05-09 16:17:58:
具体怎么做呢？

还是换这个buffer，用GE的柱子，就是脱盐柱试试。
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8楼2012-05-09 18:07:44
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+5 2012-05-10 10:56:30
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2012-05-10 10:56:38
本帖内容被屏蔽
9楼2012-05-10 09:08:47
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
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10楼2012-05-10 09:10:10
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