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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白质盐析及除盐
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cheng492

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白质盐析及除盐 已有5人参与

我是学化学的，对蛋白质不太了解，最近要做一些蛋白方面的实验，在此请教对蛋白质比较了解的人。

做对血红蛋白的改性，需要将血红蛋白盐析出来，血红蛋白等电点6.8左右，用硫酸铵盐析，需要调节调节硫酸铵的pH到多少为宜（老板说直接调节到等电点，老板也不咋懂，不知道在等电点会不会变性），盐析完成后脱盐，如果用超滤，超滤膜孔径需要多大的，离心机转速大概多少。如果用过柱子方式脱盐，需要什么型号的。
以上操作不使蛋白质变性。谢谢大家。
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1楼 2010-07-18 22:34:02
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
1949stone(金币+2):学术交流 鼓励 2010-07-18 23:47:37
cheng492(金币+5): 2010-07-19 09:09:50
蛋白的盐析和你所使用的buffer种类，pH都是相关的
等电点那蛋白是中性的，也就是不带电。这个和蛋白变性没有直接关系，而且就算你的buffer在等电点，蛋白也不一定失去活性。
salt out有很多手法，你可以看看。弄清一些基本问题后再做实验。例如一个简单问题，你为什么使用硫酸铵而不用NaCl？
至于如何除盐，方法很多。我一般用透析了。但MWCO用多少要看你的蛋白大小来定
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2楼2010-07-18 23:39:36
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cheng492

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-18 23:39:36:
蛋白的盐析和你所使用的buffer种类，pH都是相关的
等电点那蛋白是中性的，也就是不带电。这个和蛋白变性没有直接关系，而且就算你的buffer在等电点，蛋白也不一定失去活性。
salt out有很多手法，你可以看看。弄 ...

谢谢你的帮助
我不知道盐析的时候还要用缓冲液，能具体点么，
用氯化钠盐析挺好的，他的pH值刚好接近蛋白的等电点，不过他的饱和溶解度比较小，我害怕到饱和溶解度还盐析不出来，如果用硫酸铵的话是不是最好把pH调到能点点在盐析，
透析除盐我觉得太慢了，要几天吧
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3楼2010-07-19 09:09:28
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
看天(金币+3):谢谢回答 2010-07-19 12:56:00
cheng492(金币+5): 2010-07-19 21:53:49
引用回帖:
Originally posted by cheng492 at 2010-07-19 09:09:28:


谢谢你的帮助
我不知道盐析的时候还要用缓冲液，能具体点么，
用氯化钠盐析挺好的，他的pH值刚好接近蛋白的等电点，不过他的饱和溶解度比较小，我害怕到饱和溶解度还盐析不出来，如果用硫酸铵的话是不是最好 ...

蛋白的溶解一般不会直接在DI water中，毕竟有些蛋白在DI water的溶解度不算高。为了提高溶解度，蛋白有salt in这种现象，也就是说，随着盐浓度增加，蛋白溶解度增加。而且，你如果需要在某个pH下做实验，也需要buffer给予pH的保证。

我并不知道你做salt out的目的为何。具体怎么选择，需要看你的蛋白本身。NH4这种盐有一个问题是，他会和Glu-COO-形成氢键，有可能影响你的蛋白（Thomas C. Bruice_PNAS_2004_Mechanisms of ammonia activation and ammonium ion inhibition of quinoprotein methanol dehydrogenase_A computational approach）。

具体的一些情况，你需要用实验来摸索
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4楼2010-07-19 10:54:58
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ugdudx

金虫 (正式写手)
★ ★
lstt09nk(金币+2):很热心~~ 2010-07-19 18:02:45
cheng492(金币+5): 2010-07-19 21:52:56
调到等电点应当可以的呀，我们一般沉淀蛋白时也是调到等电点附近，使尽电荷为零这样的话更容易沉淀。我用硫酸铵沉淀的也是血清，不过要的是抗体，所以就调到了7.4附近，辛酸沉淀除杂蛋白时就调到杂蛋白的等电点5附近。用盐沉淀也就是是破坏蛋白的水化层达到沉淀的目的吧，
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我一直哭，一直哭，哭我没有鞋子穿，直到我遇到一个人，他没有脚。。。。
5楼2010-07-19 14:40:32
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ugdudx

金虫 (正式写手)
另外你说到截留分子量，要看你的血红蛋白的分子量大小，再选择了，关于离心力我看关于硫酸铵沉淀的从3000rpm到15000rpm的都有，应当是能使沉淀离心下来就可以吧？不用太大的离心力
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我一直哭，一直哭，哭我没有鞋子穿，直到我遇到一个人，他没有脚。。。。
6楼2010-07-19 14:49:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
楼主在这里等的同时可以百度一下相关知识和操作
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2010-07-19 14:52:08
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cheng492

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-07-19 14:52:08:
楼主在这里等的同时可以百度一下相关知识和操作

都google过了，不过感觉还是不太放心，想在这里请教一下专业人士
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8楼2010-07-19 21:41:53
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cheng492

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ugdudx at 2010-07-19 14:49:16:
另外你说到截留分子量，要看你的血红蛋白的分子量大小，再选择了，关于离心力我看关于硫酸铵沉淀的从3000rpm到15000rpm的都有，应当是能使沉淀离心下来就可以吧？不用太大的离心力

我的血红蛋白65000左右吧，用10000的滤膜行不，你们一般去盐用什么方法啊
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9楼2010-07-19 21:52:40
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cheng492

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ugdudx at 2010-07-19 14:49:16:
另外你说到截留分子量，要看你的血红蛋白的分子量大小，再选择了，关于离心力我看关于硫酸铵沉淀的从3000rpm到15000rpm的都有，应当是能使沉淀离心下来就可以吧？不用太大的离心力

谢谢
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10楼2010-07-19 21:54:42
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