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543608268金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】盐析法 已有1人参与
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请求盐析法沉淀蛋白质 配方 比如硫酸铵 等 [ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:08 ] |
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2楼2010-08-23 11:23:03
543608268
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4楼2010-08-23 13:46:22
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-25 09:49:23
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硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 • 组织培养上清液、血清样品或腹水等 • 硫酸铵（NH4）SO4 • 饱和硫酸铵溶液（SAS） • 蒸馏水 • PBS • 透析袋 • 超速离心机 • pH计 • 磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25C）； 二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000g 离心30 min（4C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS透析24-48小时（4C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时 或过夜（4C）； 3、3000g 离心30 min（4C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 |
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