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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 【求助/交流】盐析法
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543608268

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】盐析法 已有1人参与

请求盐析法沉淀蛋白质 配方 比如硫酸铵 等

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:08 ]
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1楼 2010-08-23 11:10:32
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天马0825

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yaojc at 2010-08-25 09:14:43
硫酸铵沉淀法
基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子 ...

好啊
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自信加努力成就人生
6楼2014-02-17 22:42:33
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henkally

禁虫 (著名写手)
★ ★
看天(金币+1):鼓励 2010-08-23 12:52:53
看天(金币+1):鼓励 2010-08-23 12:53:15
看天:打不开 2010-08-23 12:53:16
本帖内容被屏蔽
2楼2010-08-23 11:23:03
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henkally

禁虫 (著名写手)
543608268(金币+2): 2010-08-26 18:22:21
本帖内容被屏蔽
4楼2010-08-23 13:46:22
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yaojc

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-25 09:49:23
硫酸铵沉淀法
基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器
• 组织培养上清液、血清样品或腹水等
• 硫酸铵（NH4）SO4      
• 饱和硫酸铵溶液（SAS）
• 蒸馏水
• PBS
• 透析袋
• 超速离心机
• pH计
• 磁力搅拌器
实验步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）
将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25C）；
二、沉淀
1、样品（如腹水）20 000g  离心30 min，除去细胞碎片；
2、保留上清液并测量体积；
3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；
4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4C），使蛋白质充分沉淀。
三、透析
1、蛋白质溶液10 000g  离心30 min（4C）。弃上清保留沉淀；
2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS透析24-48小时（4C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵；
3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
应用提示
一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)；
2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时 或过夜（4C）；
3、3000g  离心30 min（4C），保留上清液；
4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；
5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；
二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；
三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
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专注、专心、专业
5楼2010-08-25 09:14:43
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