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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质等电点沉淀之后怎么重新溶解
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)

[求助] 蛋白质等电点沉淀之后怎么重新溶解

现在在做蛋白质纯化，想过阳离子交换柱，因为蛋白质稳定pH要>4.5，等电点预测在5.1左右，故选用pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，但加了之后就浑浊了，大侠们，我该怎么办
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1楼 2013-07-02 09:52:42
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-02 18:52:58
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢，我再看看 2013-07-03 14:33:48
是否精确测算过蛋白等电点？因为你的蛋白稳定要＞4.5，用4.6的缓冲液去置换，蛋白会先经过5.1的等电点沉淀，然后继续加会稍许变清，但是因为距离等电点较近，所以不会变的很清，就是说不一定会完全溶解。楼主需要考虑一下精确测量蛋白的等电点，然后选择合适的pH缓冲液。另外，层析类型也需要考虑，是否一定要用阳离子交换？
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2楼2013-07-02 11:03:11
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-02 18:53:04
鸡鸣不已: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢，我再看看 2013-07-03 14:34:01
我想问一下，你的蛋白是需要重新溶解，还是需要改进实验方法？

1. 如果是重新溶解，建议你变性溶解！选择尿素或者盐酸胍！
2.如果是改进实验方法，建议你先准确计算一下你的等电点，然后看看等电点是否很高？根据等电点做选择合适的离子柱！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
3楼2013-07-02 12:26:39
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marmot218

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-02 18:53:19
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢，我再看看 2013-07-03 14:34:21
首先等电点要准确 然后为什么不能用阴离子交换呢 如果用阴离子交换 缓冲液的选择会增加很多
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4楼2013-07-02 13:36:40
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by marmot218 at 2013-07-02 13:36:40
首先等电点要准确 然后为什么不能用阴离子交换呢 如果用阴离子交换 缓冲液的选择会增加很多

我们是先用阴离子柱，再过阳离子柱。。。尝试过ni柱，发现不行
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5楼2013-07-02 17:18:53
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-07-02 12:26:39
我想问一下，你的蛋白是需要重新溶解，还是需要改进实验方法？

1. 如果是重新溶解，建议你变性溶解！选择尿素或者盐酸胍！
2.如果是改进实验方法，建议你先准确计算一下你的等电点，然后看看等电点是否很高？根 ...

变性溶解，会使蛋白变性吗？谢谢
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6楼2013-07-02 17:19:29
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2013-07-02 11:03:11
是否精确测算过蛋白等电点？因为你的蛋白稳定要＞4.5，用4.6的缓冲液去置换，蛋白会先经过5.1的等电点沉淀，然后继续加会稍许变清，但是因为距离等电点较近，所以不会变的很清，就是说不一定会完全溶解。楼主需要考 ...

怎么准确测量等电点，我们是先过阴离子柱，再过SP阳离子柱，尝试过Ni柱，但行不通，谢谢
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7楼2013-07-02 17:20:42
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-07-02 17:19:29
变性溶解，会使蛋白变性吗？谢谢...

会！然后需要renaturation！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
8楼2013-07-02 19:53:48
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marmot218

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

可以尝试加一些表活、去污剂之类的 或者低浓度的变性剂 对有些蛋白有稳定作用
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9楼2013-07-03 09:17:31
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

纯化还是不要乱加活性剂，会导致挂不上柱子，如果是先阴再阳的纯化方式，为何不试试先阴后疏水，这样就不涉及到缓冲液的pH问题，只需要调节离子强度，相对来说会比较容易。但是疏水洗脱会困难些，要选择好洗脱液的离子强度，或者干脆走梯度。
总之你的pH比较接近等电点，不好调啊。
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10楼2013-07-03 11:03:23
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