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kabuqinuo89新虫 (小有名气)
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原核表达 蛋白质全在沉淀里，这是怎么回事啊
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| 最近在做原核表达，但是破碎细胞后，上清中什么也没有，只有沉淀里有貌似是目的条带的蛋白，如果是形成包涵体的话量应该是很大的吧，可是我的蛋白量很少，而且全都在沉淀里，实在不知道该怎么解释，求助啊………… |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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kabuqinuo89: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-12 09:53:04
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重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异性结合、蛋白质局部浓度高于溶解度。3.重组蛋白质的一级结构也与包涵体的形成有关，一般说含硫氨基酸氨基酸多的蛋白质可能易于形成包涵体，含脯氨酸多的蛋白质则明显的与形成包涵体的概率呈正相关，可能是因为脯氨酸破坏螺旋结构，而螺旋结构多位于蛋白质分子表面，有相对较强的机械强度，能够抑制蛋白质分子之间的彼此靠近和相互作用。4.重组蛋白质所处的环境可能不适宜蛋白质形成天然构象，发酵温度较高和pH接近重组蛋白质的等电点时比较容易形成包涵体。 综上述，重组蛋白质形成包涵体不一定需要绝对的巨大的表达量。 |
3楼2013-07-12 00:27:19
kx444555
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7楼2013-07-12 10:27:08
lwiaanngg
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蛋白等电点1〉Iso-electric focusing，这个比较准确，不过需要大概了解你的等电点范围后选择不同的IEF stripe。2〉软件模拟，这个大多不靠铺... 原核表达遇到这种情况，像楼上说的，原因其实比较的复杂。给你的解决的建议 1. 你先确定你表达的基因来源。有些基因的表达，他的蛋白需要特殊的charporene来帮助折叠，而你的strain没有。你可以查一些文献关于你基因的文献。同时克隆那个相应的charporene，这样可以比较好的解决。有文献提到lipase用这个方法，极大提升活性。 2. 你的载体，表达的时候，尽量少的增加一些tag，虽然大多数时候是安全的，但仍有概率造成misfolding。 3. 表达的时候，选择合适的strain。同一类的strain，有很多的亚种，例如BL21。同时在做表达的时候，一个比较好用的方法就是诱导前30 min开始降温表达。不过需要你摸索一下条件了。 |
9楼2013-07-12 11:20:29
kx444555
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kabuqinuo89: 金币+2 2013-07-12 09:50:49
| 包涵体的形成不一定是蛋白表达量高才聚集形成的，有可能蛋白本身性质决定了它就是疏水性的，你后续要做什么试验？ |
kabuqinuo892楼2013-07-11 22:27:12
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