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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)

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[求助] 原核表达蛋白质全在沉淀里，这是怎么回事啊

最近在做原核表达，但是破碎细胞后，上清中什么也没有，只有沉淀里有貌似是目的条带的蛋白，如果是形成包涵体的话量应该是很大的吧，可是我的蛋白量很少，而且全都在沉淀里，实在不知道该怎么解释，求助啊…………

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1楼 2013-07-11 21:11:40

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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

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引用回帖:

8楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2013-07-12 10:27:18
我想再问下，如果培养基的PH为6.7，而我表达的重组蛋白质的pH为6.0-6.4左右，那么这个培养基的等电点算不算接近我重组蛋白质的等电点呢...

蛋白等电点1〉Iso-electric focusing，这个比较准确，不过需要大概了解你的等电点范围后选择不同的IEF stripe。2〉软件模拟，这个大多不靠铺...

原核表达遇到这种情况，像楼上说的，原因其实比较的复杂。给你的解决的建议
1. 你先确定你表达的基因来源。有些基因的表达，他的蛋白需要特殊的charporene来帮助折叠，而你的strain没有。你可以查一些文献关于你基因的文献。同时克隆那个相应的charporene，这样可以比较好的解决。有文献提到lipase用这个方法，极大提升活性。
2. 你的载体，表达的时候，尽量少的增加一些tag，虽然大多数时候是安全的，但仍有概率造成misfolding。
3. 表达的时候，选择合适的strain。同一类的strain，有很多的亚种，例如BL21。同时在做表达的时候，一个比较好用的方法就是诱导前30 min开始降温表达。不过需要你摸索一下条件了。

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