| 查看: 7241 | 回复: 22 | ||||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||
ningxi123456金虫 (小有名气)
|
[求助]
原核表达形成了包涵体怎么办啊？
|
|||||
|
我的目的基因是水稻中克隆出来的，连到PET24上做原核表达，表达出来了，大小也对，但是在纯化跑SDS-PAGE电泳后发现它在沉淀里面，形成了包涵体。该怎么办啊？原核表达我都做了半年了，现在形成了包涵体，更是郁闷，各位大侠，谁能帮我解决下啊，感激不尽~！！！ 我的目的蛋白大概38Da，按1:100加入500ml的LB培养基中摇菌至OD600=0.6，加入0.7mM的IPTG，37°C诱导三个小时。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 | 核酸生物学实验经验 | 【分子生物】EPI帖 | 实验求助 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有88人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
低温诱导蛋白表达时用多少度合适？
已经有16人回复- 原核表达蛋白纯化
已经有32人回复
- 原核表达蛋白复性的具体方案
已经有14人回复
- 原核上清表达条件
已经有6人回复
- 原核表达 蛋白质全在沉淀里，这是怎么回事啊
已经有12人回复
- 原核表达做不出来了！
已经有15人回复
- 关于原核表达结果的分析及原因
已经有9人回复
- 关于重组蛋白包涵体的溶解及复性
已经有5人回复
- 原核表达重组表达载体的连问题
已经有14人回复
- 原核表达载体蛋白诱导
已经有18人回复
- 原核表达His-tag怎么去除
已经有3人回复
- 原核表达和SDS-PAGE
已经有9人回复
- 我的蛋白在大肠杆菌中表达量低怎么办？
已经有7人回复
- 原核表达重组质粒提取
已经有7人回复
- 浇注料养护后胚体开裂，为什么？？
已经有5人回复
- 原核表达中SDS-PAGE上样量如何确定？
已经有7人回复
- 【求助/交流】请教关于诱导表达产生包涵体问题
已经有3人回复
- 【求助/交流】原核表达，预测的信号肽序列是否包括
已经有7人回复
- 【求助/交流】原核表达去载体序列被翻译后该如何去掉
已经有5人回复
- 【求助】拉伸样条与万能试验机的夹具相对滑移怎么办？
已经有11人回复
- [求助]原核表达如何减少包涵体
已经有23人回复
imyting
至尊木虫 (正式写手)
- MolEPI: 6
- 应助: 66 (初中生)
- 金币: 10214.2
- 散金: 658
- 红花: 5
- 帖子: 805
- 在线: 167.6小时
- 虫号: 736362
- 注册: 2009-03-31
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 19:04:56
amisking: 回帖置顶 2012-03-26 19:55:20
amisking: MolEPI+1, 鼓励新虫发帖交流！ 2012-03-26 19:55:26
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 19:04:56
amisking: 回帖置顶 2012-03-26 19:55:20
amisking: MolEPI+1, 鼓励新虫发帖交流！ 2012-03-26 19:55:26
|
我也遇到过这种情况，的确很难解决，我觉得可以从以下几点尝试： 1.降低温度，最容易想到的方法，文献中有很多都是这么做的，但是有时候效果并不是很明显，最多可降至8℃； 2.分析自己序列的疏水氨基酸含量，并进行信号肽预测，必要时可将信号肽切除，因为一般来说信号肽中疏水氨基酸多，会影响蛋白质可溶； 3.可以做一个OD值的梯度，OD0.4-0.6是分子克隆提供的条件，很多文献也这么做，但是这个条件不适合溶解性低的蛋白，OD1.0时效果一般比较好，你可以试试别的OD值。 4.IPTG的浓度影响不太大，但是我试过将IPTG浓度降低十倍，一点儿也不影响效果，IPTG价格还是比较贵的，能省就省吧。 5.如果上述都不行，就只剩最后一种方法了，换载体，对于研究生来说周期应该也不长，毕竟都做过这个，例如PET-30a之类的。 |
3楼2012-03-26 17:43:29
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励新虫积极应助交流哈 2012-04-06 10:07:45
ningxi123456: 金币+2 2012-04-10 15:38:43
ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:31:14
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励新虫积极应助交流哈 2012-04-06 10:07:45
ningxi123456: 金币+2 2012-04-10 15:38:43
ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:31:14
| 在原核细胞中的表达，要受原核细胞基因表达的多级调控影响，如基因结构的调控。利用宿主菌的调控系统调节外源基因的表达，防止外源基因的表的产物对宿主菌毒害如包涵体。那既然是这样的原因，是不是可以做点什么让包涵体进行裂解呢？？然后包涵体裂解物经过透析复性后,应该可获得较高纯度的复性目的蛋白。至于如何裂解包涵体，应该去找一些文献，看看！ |
6楼2012-04-06 10:02:08
yanfeier
金虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1464.1
- 散金: 65
- 红花: 2
- 帖子: 245
- 在线: 173.1小时
- 虫号: 821917
- 注册: 2009-08-04
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
8楼2012-04-06 15:18:16
zhaohq1209
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 41 (小学生)
- 贵宾: 0.034
- 金币: 10666.7
- 散金: 587
- 红花: 12
- 帖子: 2113
- 在线: 333.7小时
- 虫号: 243823
- 注册: 2006-04-15
- 专业: 病原细菌、细菌感染与宿主
2楼2012-03-26 17:07:53
ningxi123456
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 534.5
- 红花: 3
- 帖子: 65
- 在线: 27.5小时
- 虫号: 1004286
- 注册: 2010-04-23
- 性别: MM
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
4楼2012-03-26 19:04:15
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 恩，很热心哦 2012-03-27 11:17:18
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 恩，很热心哦 2012-03-27 11:17:18
|
事实上，大部分外源蛋白在大肠杆菌中表达时都是形成包涵体（除非一些较小的，二硫键较少（1对）的）。 解决办法一般有三个： 1： 与一些助溶的蛋白融合表达：如：常用的GST，TrxA融合表达载体等 2：共表达一些伴侣类分子，如Dsb系列，等有大量文献报道，但不如1的效果好。 3.改变表达条件：如上所述，包括降低诱导强度（IPTG=0.1mM),降低诱导温度（12-16度）等，然后从裂菌上清中纯化可溶的部分，有时候，也能得到足够的可溶蛋白（如果你加了Histag方便纯化） 听起来，你们实验室的分子生物学不是强项，否则，可以很快将集中最常用的融合表达都试一遍。如果3还不行，则直接考虑做变性复性吧，还是可以得到一点可溶蛋白的 |
5楼2012-03-26 21:26:48
whb21
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 105 (高中生)
- 金币: 9711.3
- 散金: 625
- 红花: 7
- 帖子: 2994
- 在线: 172.4小时
- 虫号: 928584
- 注册: 2009-12-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2012-04-06 11:05:23
btx362237729
金虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 927.7
- 散金: 74
- 红花: 3
- 帖子: 745
- 在线: 66.3小时
- 虫号: 1069351
- 注册: 2010-08-04
- 性别: GG
- 专业: 疫苗学
9楼2012-04-06 18:39:03
xiaogang0301
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 190.5
- 帖子: 9
- 在线: 2.1小时
- 虫号: 1204171
- 注册: 2011-02-16
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
10楼2012-04-13 10:53:59