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imyting

至尊木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 19:04:56
amisking: 回帖置顶 2012-03-26 19:55:20
amisking: MolEPI+1, 鼓励新虫发帖交流！ 2012-03-26 19:55:26

我也遇到过这种情况，的确很难解决，我觉得可以从以下几点尝试：
1.降低温度，最容易想到的方法，文献中有很多都是这么做的，但是有时候效果并不是很明显，最多可降至8℃；
2.分析自己序列的疏水氨基酸含量，并进行信号肽预测，必要时可将信号肽切除，因为一般来说信号肽中疏水氨基酸多，会影响蛋白质可溶；
3.可以做一个OD值的梯度，OD0.4-0.6是分子克隆提供的条件，很多文献也这么做，但是这个条件不适合溶解性低的蛋白，OD1.0时效果一般比较好，你可以试试别的OD值。
4.IPTG的浓度影响不太大，但是我试过将IPTG浓度降低十倍，一点儿也不影响效果，IPTG价格还是比较贵的，能省就省吧。
5.如果上述都不行，就只剩最后一种方法了，换载体，对于研究生来说周期应该也不长，毕竟都做过这个，例如PET-30a之类的。

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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便

3楼2012-03-26 17:43:29

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panda73

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 恩，很热心哦 2012-03-27 11:17:18

事实上，大部分外源蛋白在大肠杆菌中表达时都是形成包涵体（除非一些较小的，二硫键较少（1对）的）。
解决办法一般有三个：
1：与一些助溶的蛋白融合表达：如：常用的GST，TrxA融合表达载体等
2：共表达一些伴侣类分子，如Dsb系列，等有大量文献报道，但不如1的效果好。
3.改变表达条件：如上所述，包括降低诱导强度（IPTG=0.1mM),降低诱导温度（12-16度）等，然后从裂菌上清中纯化可溶的部分，有时候，也能得到足够的可溶蛋白（如果你加了Histag方便纯化）
听起来，你们实验室的分子生物学不是强项，否则，可以很快将集中最常用的融合表达都试一遍。如果3还不行，则直接考虑做变性复性吧，还是可以得到一点可溶蛋白的

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5楼2012-03-26 21:26:48

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