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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体蛋白诱导
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达载体蛋白诱导

现构建pet28a+目的片段原核表达载体，目的片段带TAG终止密码子（重组质粒测序正确），IPTG诱导蛋白表达后理论蛋白大小约为19KD，现诱导后跑SDS-PAGE在20KD大小处出现目的蛋白！但用6*HIS tag标签抗体做western blot发现出现目的条带的确是14KD左右的蛋白！见图！这是为什么呢？将14KD蛋白切下做质谱鉴定并非所需目的蛋白！
望大侠们赐教！！！！！！

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1楼 2013-02-12 21:34:02
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 很有可能啊，提前终止是很常见的哦 2013-02-17 13:38:59
两个建议，第一，您的目的基因是不是是不是含有一些稀有的密码子，我的一个朋友曾经出过同样的问题，建议做一下检查，如果带有，细菌表达时经常会出现提前终止，第二，或者你可以换一种表达的细菌。
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immunologyparasite
2楼2013-02-12 22:30:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Western有时候也不一定正确。你是否把20kD的蛋白也打质谱了？此外，你可以把诱导上清上镍柱看看能否纯化到蛋白。
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3楼2013-02-13 00:30:16
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robustli at 2013-02-12 22:30:35
两个建议，第一，您的目的基因是不是是不是含有一些稀有的密码子，我的一个朋友曾经出过同样的问题，建议做一下检查，如果带有，细菌表达时经常会出现提前终止，第二，或者你可以换一种表达的细菌。

非常感谢！可是即使是提前终止，蛋白质谱鉴定的结果怎么会和目的蛋白完全不同呢？他们应该会有重合序列吧？
那么会不会是质粒本身的问题呢？
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4楼2013-02-13 20:34:41
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-13 00:30:16
Western有时候也不一定正确。你是否把20kD的蛋白也打质谱了？此外，你可以把诱导上清上镍柱看看能否纯化到蛋白。

western 也不一定正确？您的意思是，过镍柱，再做western？
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5楼2013-02-13 20:35:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-02-17 13:39:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-13 20:35:24
western 也不一定正确？您的意思是，过镍柱，再做western？...

抗his的抗体有时候有非特异识别，对目的蛋白是识别效果却不是很好。既然你有打质谱的条件，把诱导出来的这个带打一下看看比较保险。此外，你把目标蛋白带上his标签，目的不是为了纯化方便吗？所以让你试试看是不是可以纯化到目的蛋白。
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6楼2013-02-14 14:35:46
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-14 14:35:46
抗his的抗体有时候有非特异识别，对目的蛋白是识别效果却不是很好。既然你有打质谱的条件，把诱导出来的这个带打一下看看比较保险。此外，你把目标蛋白带上his标签，目的不是为了纯化方便吗？所以让你试试看是不是 ...

与非特异性蛋白结合而不与特异性蛋白结合，还有这种情况？您说有没可能是我载体的问题呢？
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7楼2013-02-14 18:54:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流，新年快乐 2013-02-17 13:39:33
引用回帖:
7楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-14 18:54:32
与非特异性蛋白结合而不与特异性蛋白结合，还有这种情况？您说有没可能是我载体的问题呢？...

构建好的载体你不是测序正确了吗？如果序列正确应该是没问题的。14kD的蛋白在未诱导及空质粒都有明显条带，应该不是目的蛋白。而20kD的蛋白在诱导沉淀中明显增多，可能是形成包涵体了。但不清楚为什么你的诱导上清蛋白量很少，是超声没做好吗？由于14kD蛋白的丰度比较高，你的western可能是非特异杂带。不清楚为什么你表达的目的蛋白western没有信号。我觉得20kD的蛋白非常可能是正确的目标蛋白，做质谱就能解答你的疑惑了。
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8楼2013-02-15 08:29:17
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-15 08:29:17
构建好的载体你不是测序正确了吗？如果序列正确应该是没问题的。14kD的蛋白在未诱导及空质粒都有明显条带，应该不是目的蛋白。而20kD的蛋白在诱导沉淀中明显增多，可能是形成包涵体了。但不清楚为什么你的诱导上清 ...

非常感谢您的解答！蛋白形成包涵体的话会影响western的鉴定吗？
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9楼2013-02-15 11:46:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-15 11:46:57
非常感谢您的解答！蛋白形成包涵体的话会影响western的鉴定吗？...

包涵体中的蛋白是非活性形式的变性蛋白，但不影响SDS-PAGE后做western。
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10楼2013-02-15 12:37:03
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