应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达引物设计的问题
71/1返回列表
查看: 1869  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

尚轩舞雪

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达引物设计的问题

我要原核表达一个蛋白质，表达载体是PET-32a（+），现有下面几个问题要请教一下：
1. 设计引物的时候需不需要去掉终止子（TAA）和起始子（ATG）？
2. 我用的酶切位点是EcoRI和XhoI，这两个酶切位点前加几个保护碱基合适并且不会造成译码突变?
3.  另外我不打算纯化表达的蛋白，只是做个SDS-PAGE电泳和Western验证下抗体的特异性，所以我表达蛋白时是做个全长ORF的，还是一个肽段序列比较好？
4. 原核表达蛋白的大小应该怎么确定？
  各位大侠帮我一下，我身边的人都不做这方面的实验，所以做起来问题很多，望大家帮我一下
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【经验-心得】

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-10-29 14:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-29 16:06:08
设计引物不一定要去掉终止子和起始子，这需要看你表达载体的特性，这个载体我没用过不太清楚
一般来说在酶切位点之前加保护碱基不会造成译码突变，因为你酶切的时候都能切掉
一般不建议一个肽段，如果能知道某个肽段是抗原决定簇也可以
蛋白大小=碱基数X110／３
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-29 15:56:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xj0311 at 2012-10-29 15:56:52
设计引物不一定要去掉终止子和起始子，这需要看你表达载体的特性，这个载体我没用过不太清楚
一般来说在酶切位点之前加保护碱基不会造成译码突变，因为你酶切的时候都能切掉
一般不建议一个肽段，如果能知道某个肽 ...

就是说，我直接在引物两端加上载体MCS上有的酶切位点（最好是6个三碱基的）。全长引物含起始子和终止子也没关系？
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-30 10:26:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是的，酶切位点可以在网上查到，全长含有起始子和终止子有没有关系与你的载体有关
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-01 09:43:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xj0311 at 2012-11-01 09:43:05
是的，酶切位点可以在网上查到，全长含有起始子和终止子有没有关系与你的载体有关

我要用PET-32a（+）载体，那还要不要在全长中包含起始子和终止子
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-01 10:42:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
尚轩舞雪: 金币+2, ★★★很有帮助, 还是很感谢 2012-11-03 09:11:21
对不起，这个载体我没用过，你可以问问老师或者是师兄，师姐，抱歉
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-02 10:13:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

messi1910

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-02 13:55:36
尚轩舞雪: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 谢谢，学习了 2012-11-03 09:11:54
pet32a这个载体好像有189个氨基酸，约20KD，pET-32a空载体表达的蛋白序列如下：MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRRQACGRTRAPPPPPLRSGC

保护位点碱基数目几个都无所谓，酶切就掉了。

最好表达全长，只是多肽的话，理论上，如果你的抗体不是针对这个表位产生的抗体，那WB就是隐形哦，所以表达蛋白可以稍微大些，抗原表位就多些，得到阳性信号的可能性大些。
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-02 11:31:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 尚轩舞雪 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +5 Ncdx123456 2026-03-13 6/300 2026-03-15 23:39 by lovewei0727
[考博] 欢迎申博同学联系 +3 天道酬勤2026686 2026-03-10 7/350 2026-03-15 19:03 by 天道酬勤2026686
[考研] 289求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-14 6/300 2026-03-14 18:58 by userper
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 求调剂 +6 yfihxh 2026-03-09 6/300 2026-03-14 01:18 by JourneyLucky
[考研] 招收0805（材料）调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] b区环境工程求调剂 +4 Maps1 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:23 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +5 邱gl 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:37 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +8 困于星晨 2026-03-12 10/500 2026-03-13 15:42 by ms629
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 材料调剂，307分 +13 张泳铭1 2026-03-09 17/850 2026-03-13 11:09 by 薛云鹏
[考研] 0856化工原理 +6 z2839474511 2026-03-10 6/300 2026-03-13 10:41 by houyaoxu
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +4 薛云鹏 2026-03-13 4/200 2026-03-13 10:40 by 学员8dgXkO
[考研] 290求调剂 +3 ADT 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:19 by peike
[考研] 085600 材料与化工 295 求调剂 +10 dream…… 2026-03-10 12/600 2026-03-12 13:46 by dream……
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭