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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达引物设计的问题

我要原核表达一个蛋白质，表达载体是PET-32a（+），现有下面几个问题要请教一下：
1. 设计引物的时候需不需要去掉终止子（TAA）和起始子（ATG）？
2. 我用的酶切位点是EcoRI和XhoI，这两个酶切位点前加几个保护碱基合适并且不会造成译码突变?
3.  另外我不打算纯化表达的蛋白，只是做个SDS-PAGE电泳和Western验证下抗体的特异性，所以我表达蛋白时是做个全长ORF的，还是一个肽段序列比较好？
4. 原核表达蛋白的大小应该怎么确定？
  各位大侠帮我一下，我身边的人都不做这方面的实验，所以做起来问题很多，望大家帮我一下
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1楼 2012-10-29 14:33:37
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-29 16:06:08
设计引物不一定要去掉终止子和起始子，这需要看你表达载体的特性，这个载体我没用过不太清楚
一般来说在酶切位点之前加保护碱基不会造成译码突变，因为你酶切的时候都能切掉
一般不建议一个肽段，如果能知道某个肽段是抗原决定簇也可以
蛋白大小=碱基数X110／３
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2楼2012-10-29 15:56:52
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xj0311 at 2012-10-29 15:56:52
设计引物不一定要去掉终止子和起始子，这需要看你表达载体的特性，这个载体我没用过不太清楚
一般来说在酶切位点之前加保护碱基不会造成译码突变，因为你酶切的时候都能切掉
一般不建议一个肽段，如果能知道某个肽 ...

就是说，我直接在引物两端加上载体MCS上有的酶切位点（最好是6个三碱基的）。全长引物含起始子和终止子也没关系？
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3楼2012-10-30 10:26:57
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是的，酶切位点可以在网上查到，全长含有起始子和终止子有没有关系与你的载体有关
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4楼2012-11-01 09:43:05
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xj0311 at 2012-11-01 09:43:05
是的，酶切位点可以在网上查到，全长含有起始子和终止子有没有关系与你的载体有关

我要用PET-32a（+）载体，那还要不要在全长中包含起始子和终止子
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5楼2012-11-01 10:42:21
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
尚轩舞雪: 金币+2, ★★★很有帮助, 还是很感谢 2012-11-03 09:11:21
对不起，这个载体我没用过，你可以问问老师或者是师兄，师姐，抱歉
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6楼2012-11-02 10:13:06
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messi1910

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-02 13:55:36
尚轩舞雪: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 谢谢，学习了 2012-11-03 09:11:54
pet32a这个载体好像有189个氨基酸，约20KD，pET-32a空载体表达的蛋白序列如下：MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRRQACGRTRAPPPPPLRSGC

保护位点碱基数目几个都无所谓，酶切就掉了。

最好表达全长，只是多肽的话，理论上，如果你的抗体不是针对这个表位产生的抗体，那WB就是隐形哦，所以表达蛋白可以稍微大些，抗原表位就多些，得到阳性信号的可能性大些。
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7楼2012-11-02 11:31:58
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