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原核表达引物设计的问题
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我要原核表达一个蛋白质，表达载体是PET-32a（+），现有下面几个问题要请教一下： 1. 设计引物的时候需不需要去掉终止子（TAA）和起始子（ATG）？ 2. 我用的酶切位点是EcoRI和XhoI，这两个酶切位点前加几个保护碱基合适并且不会造成译码突变? 3. 另外我不打算纯化表达的蛋白，只是做个SDS-PAGE电泳和Western验证下抗体的特异性，所以我表达蛋白时是做个全长ORF的，还是一个肽段序列比较好？ 4. 原核表达蛋白的大小应该怎么确定？ 各位大侠帮我一下，我身边的人都不做这方面的实验，所以做起来问题很多，望大家帮我一下 |
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xj0311
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6楼2012-11-02 10:13:06
【答案】应助回帖
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pet32a这个载体好像有189个氨基酸，约20KD，pET-32a空载体表达的蛋白序列如下：MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRRQACGRTRAPPPPPLRSGC 保护位点碱基数目几个都无所谓，酶切就掉了。 最好表达全长，只是多肽的话，理论上，如果你的抗体不是针对这个表位产生的抗体，那WB就是隐形哦，所以表达蛋白可以稍微大些，抗原表位就多些，得到阳性信号的可能性大些。 |
7楼2012-11-02 11:31:58
