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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体蛋白诱导
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-15 12:37:03
包涵体中的蛋白是非活性形式的变性蛋白，但不影响SDS-PAGE后做western。...

那么这种情况要怎么处理呢？即使20KD处是我要的蛋白，但没有his标签我纯化不了啊！
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11楼2013-02-15 16:12:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-15 16:12:19
那么这种情况要怎么处理呢？即使20KD处是我要的蛋白，但没有his标签我纯化不了啊！...

western没做出来不一定就没有his-tag，你构建的载体上是带标签的吧。所以我觉得你先鉴定一下20kD的蛋白，如果正确可以试试过一下镍柱看看。如果实在不挂柱的话，可以先分离包涵体。包涵体里面基本上都是目的蛋白，你再把包涵体复性得到活性蛋白。
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qinhuan0425
12楼2013-02-16 07:30:24
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-16 07:30:24
western没做出来不一定就没有his-tag，你构建的载体上是带标签的吧。所以我觉得你先鉴定一下20kD的蛋白，如果正确可以试试过一下镍柱看看。如果实在不挂柱的话，可以先分离包涵体。包涵体里面基本上都是目的蛋白， ...

太感谢您了！
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13楼2013-02-16 13:15:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-16 13:15:41
太感谢您了！...

不客气，祝实验顺利。
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14楼2013-02-16 13:30:01
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-16 13:30:01
不客气，祝实验顺利。...

可是western做不出来，只有蛋白大小，目的蛋白没有说服力呀！
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15楼2013-02-16 19:01:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by qinhuan0425 at 2013-02-16 19:01:36
可是western做不出来，只有蛋白大小，目的蛋白没有说服力呀！...

如果打质谱正确的话不是更有说服力吗。再说，western做不出来有可能是抗体的问题。你可以试试换一家公司的抗体。
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16楼2013-02-17 02:54:43
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-17 02:54:43
如果打质谱正确的话不是更有说服力吗。再说，western做不出来有可能是抗体的问题。你可以试试换一家公司的抗体。...

哦！这样啊！
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17楼2013-02-17 11:00:29
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lying09

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

目标蛋白上带有His-tag，会使最终的蛋白在电泳条带上偏大
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18楼2013-02-18 09:12:16
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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lying09 at 2013-02-18 09:12:16
目标蛋白上带有His-tag，会使最终的蛋白在电泳条带上偏大

是的！大2-3KD!把这个大小算进去了！
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19楼2013-02-18 11:16:22
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