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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 原核表达中SDS-PAGE上样量如何确定？

采用默克表达手册上标准SDS-PAGE凝胶上样量计算方法计算上样量，10孔小胶：270uL/（样品浓缩系数*OD600），可是我是从OD600为0.638开始诱导的，菌液处理是取500微升最后用100微升loading重悬，样品浓缩系数为5，按这样算下来我的上样量为86微升，弱弱的问一下，10孔小胶的一个胶孔中能上这么多样吗？
还有大家诱导以后是怎么确定上样量的啊？本人新手，也没人知道，只能在这儿求教各位了！
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1楼 2011-08-27 10:39:47
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-27 10:39:47:
采用默克表达手册上标准SDS-PAGE凝胶上样量计算方法计算上样量，10孔小胶：270uL/（样品浓缩系数*OD600），可是我是从OD600为0.638开始诱导的，菌液处理是取500微升最后用100微升loading重悬，样品浓缩系数为5，按 ...

补充一下，按上面的公式算下来，我最小的上样量是诱导5h以后的，为22.64微升。
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2楼2011-08-27 10:40:58
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
friya0910(金币+2): 2011-08-27 12:47:47
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-28 09:47:01
一般小孔上样量不超过20微，如果是22.64，应该差不多，86微太多了
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3楼2011-08-27 12:21:22
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 叶心飞翔 at 2011-08-27 12:21:22:
一般小孔上样量不超过20微，如果是22.64，应该差不多，86微太多了

可我就是按照那个公式算的，因为随着培养时间的延长，菌液浓度增大，如果都上一样的量的话，那就不能看出蛋白的表达量的变化趋势了啊!
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4楼2011-08-27 12:57:53
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)
★
friya0910(金币+1): 2011-08-28 14:41:11
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-08-28 16:53:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-26 16:57:53:
可我就是按照那个公式算的，因为随着培养时间的延长，菌液浓度增大，如果都上一样的量的话，那就不能看出蛋白的表达量的变化趋势了啊!

你在摸索条件吗？你可以缩小相同的倍数，这样也具有可比性。
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5楼2011-08-27 18:32:18
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friya0910

新虫 (正式写手)
西瓜: 摸索条件时不必太纠结，做就是啦 2011-08-28 16:55:08
引用回帖:
5楼: Originally posted by 叶心飞翔 at 2011-08-27 18:32:18:
你在摸索条件吗？你可以缩小相同的倍数，这样也具有可比性。

是的，我也这么打算的，跑跑看吧！
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6楼2011-08-28 14:41:43
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:41
friya0910(金币+2): 2011-08-29 08:48:13
看了半天没有看懂你所说的计算方法，现在我来说一个比较简单的方法吧.
原核表达SDS-PAGE样品制做时，浓缩到A600=20左右可以获得比好的电泳结果，下面以5xloading buffer为例来说一下：
如果你的菌液A600长到了4.0，取发酵液1ml，12000rpm离心2min，弃上清800ul，余下的吹系均匀，取20ul，加5ul 5xloading buffer，沸水浴5分钟，12000rpm离心2min，上清即可做为电泳样品，大孔胶时上样10ul，小孔胶时上样5ul，只要没有其它的问题，保证你会得到一张很好的电泳结果
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7楼2011-08-29 00:57:39
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梦想天行8楼
2016-10-16 21:32   回复  
friya0910(金币+1): 谢谢参与
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