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friya0910

新虫 (正式写手)


[交流] 原核表达中SDS-PAGE上样量如何确定?

采用默克表达手册上标准SDS-PAGE凝胶上样量计算方法计算上样量,10孔小胶:270uL/(样品浓缩系数*OD600),可是我是从OD600为0.638开始诱导的,菌液处理是取500微升最后用100微升loading重悬,样品浓缩系数为5,按这样算下来我的上样量为86微升,弱弱的问一下,10孔小胶的一个胶孔中能上这么多样吗?
还有大家诱导以后是怎么确定上样量的啊?本人新手,也没人知道,只能在这儿求教各位了!
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:41
friya0910(金币+2): 2011-08-29 08:48:13
看了半天没有看懂你所说的计算方法,现在我来说一个比较简单的方法吧.
原核表达SDS-PAGE样品制做时,浓缩到A600=20左右可以获得比好的电泳结果,下面以5xloading buffer为例来说一下:
如果你的菌液A600长到了4.0,取发酵液1ml,12000rpm离心2min,弃上清800ul,余下的吹系均匀,取20ul,加5ul 5xloading buffer,沸水浴5分钟,12000rpm离心2min,上清即可做为电泳样品,大孔胶时上样10ul,小孔胶时上样5ul,只要没有其它的问题,保证你会得到一张很好的电泳结果
7楼2011-08-29 00:57:39
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friya0910

新虫 (正式写手)


引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-27 10:39:47:
采用默克表达手册上标准SDS-PAGE凝胶上样量计算方法计算上样量,10孔小胶:270uL/(样品浓缩系数*OD600),可是我是从OD600为0.638开始诱导的,菌液处理是取500微升最后用100微升loading重悬,样品浓缩系数为5,按 ...

补充一下,按上面的公式算下来,我最小的上样量是诱导5h以后的,为22.64微升。
2楼2011-08-27 10:40:58
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)


★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
friya0910(金币+2): 2011-08-27 12:47:47
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-28 09:47:01
一般小孔上样量不超过20微,如果是22.64,应该差不多,86微太多了
3楼2011-08-27 12:21:22
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friya0910

新虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 叶心飞翔 at 2011-08-27 12:21:22:
一般小孔上样量不超过20微,如果是22.64,应该差不多,86微太多了

可我就是按照那个公式算的,因为随着培养时间的延长,菌液浓度增大,如果都上一样的量的话,那就不能看出蛋白的表达量的变化趋势了啊!
4楼2011-08-27 12:57:53
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简单回复
2016-10-16 21:32   回复  
friya0910(金币+1): 谢谢参与
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