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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于重组蛋白包涵体的溶解及复性
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jessica_nn

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于重组蛋白包涵体的溶解及复性

现在在做一个微生物诱导酶的研究，此酶诱导后主要以包涵体形式存在，现在想分离纯化此酶，有没有做过包涵体溶解及复性的高手可以指导下，具体应该怎么做？怎么溶解包涵体，溶解后怎么复性？谢谢
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1楼2013-04-15 13:38:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-15 16:21:51
jessica_nn: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-19 20:34:01
包涵体溶解

我没有空给你重新录入，一会儿要去开会，我就把以前写的拷贝一下。

一个Protocol:1.粉碎大肠杆菌，立新收集包涵体，加入0.01mmol/L PMSF（新鲜配制），50mmol/L(pH=8.0), 1mmol/L EDTA， 1mmol/LNaCl, 8mol/L,配成溶液，室温作用约1小时，过程中可用手轻轻摇匀，一般不用上摇床。2.加入上述溶液的9倍体积的 50 mmol/L KH2PO4(pH=10)，1mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl, 室温约30-40分钟。第二步用NaOH将反应体系的pH调至10，配置缓冲溶液时即做到，如不行再做后调整。3.用HCl 将溶液的pH调至约8.0，室温30分钟。4.在4摄氏度下，10000-13000rpm 离心 15分钟或稍长时间，收集上清液和沉淀。5.将上清液和沉淀于SDS-PAGE上样缓冲溶液混合，100 摄氏度煮沸5-10分钟，SDS-PAGE 电泳分析，观察溶解效果。以上流程可以根据实际操作，适当修改，也用6mol/L盐酸胍对包涵体 进行溶解，电泳前用透析或超滤去除掉盐酸胍。
包涵体颗粒在溶解之前当然可以机械粉碎，再加变性剂溶解，这是因为增大了反应的表面积，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失，但是目前包涵体变性后复性收率达不到30%以上，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失完全可以通过增加反应速度和溶解率来加以补偿。
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2楼2013-04-15 14:53:02
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

另一个protocol: Purification of inclusion bodies and refolding of proteins

http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html
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3楼2013-04-15 14:55:35
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jessica_nn

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-15 14:53:02
包涵体溶解

我没有空给你重新录入，一会儿要去开会，我就把以前写的拷贝一下。

一个Protocol:1.粉碎大肠杆菌，立新收集包涵体，加入0.01mmol/L PMSF（新鲜配制），50mmol/L(pH=8.0), 1mmol/L EDTA， 1mmol/LN ...

50mmol/L(pH=8.0)是什么溶液，Tris-HCl吗？8mol/L的溶液是尿素吧？PMSF和EDTA的作用是什么？我做的蛋白pI是6.62，调节pH的时候也需要先调到10再调回8吗？我是新手，请帮忙解答一下这些问题，谢谢！
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4楼2013-04-19 20:38:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
“50mmol/L(pH=8.0)”是50mmol/LTris-HCl(pH=8.0)”，“8mol/L”是“8mol/L尿素”，不好意思录入时丢了字。

PMSF是phenylemethylsulfonyl fluoride,苯甲基磺酰氟，是丝氨酸蛋白酶的抑制剂；EDTA的作用是螯合二价阳离子。
你做的蛋白pI是6.62，调节pH的时候也需要先调到10再调回8吗？不用。
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5楼2013-04-19 23:14:07
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jessica_nn

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-19 23:14:07
“50mmol/L(pH=8.0)”是50mmol/LTris-HCl(pH=8.0)”，“8mol/L”是“8mol/L尿素”，不好意思录入时丢了字。

PMSF是phenylemethylsulfonyl fluoride,苯甲基磺酰氟，是丝氨酸蛋白酶的抑制剂；EDTA的作用是螯合二价 ...

再麻烦一下，我用你给的方法试了一下，结果复性的时候蛋白沉淀了，怎么回事呢？
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6楼2013-04-23 20:33:43
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