| 查看: 1777 | 回复: 5 | |||||
jessica_nn铜虫 (初入文坛)
|
[求助]
关于重组蛋白包涵体的溶解及复性
|
现在在做一个微生物诱导酶的研究，此酶诱导后主要以包涵体形式存在，现在想分离纯化此酶，有没有做过包涵体溶解及复性的高手可以指导下，具体应该怎么做？怎么溶解包涵体，溶解后怎么复性？谢谢 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有190人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 包涵体溶解问题
已经有13人回复
- 带有精氨酸及尿素的变性蛋白如何纯化？
已经有3人回复
- 如何解决包涵体复性沉淀问题？
已经有16人回复
- 原核表达形成了包涵体怎么办啊？
已经有22人回复
- 变性溶解的包涵体粒径
已经有3人回复
- 中试研究和稳定性考察可以在集团总部下属的了公司研究吗？
已经有6人回复
- 包涵体蛋白纯化
已经有1人回复
- 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？
已经有17人回复
- TEV酶的纯化出问题了，求解？？、
已经有9人回复
- 包涵体洗涤后8M尿素不溶解
已经有7人回复
- 纯化后的蛋白做western，出现很明显的两条带，请问是二聚体吗？怎么打开成单体？
已经有11人回复
- 【求助】包涵体表达与可溶性表达
已经有6人回复
- 【分享】蛋白质纯化个人总结2
已经有38人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-15 16:21:51
jessica_nn: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-19 20:34:01
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-15 16:21:51
jessica_nn: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-19 20:34:01
|
包涵体溶解 我没有空给你重新录入，一会儿要去开会，我就把以前写的拷贝一下。 一个Protocol:1.粉碎大肠杆菌，立新收集包涵体，加入0.01mmol/L PMSF（新鲜配制），50mmol/L(pH=8.0), 1mmol/L EDTA， 1mmol/LNaCl, 8mol/L,配成溶液，室温作用约1小时，过程中可用手轻轻摇匀，一般不用上摇床。2.加入上述溶液的9倍体积的 50 mmol/L KH2PO4(pH=10)，1mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl, 室温约30-40分钟。第二步用NaOH将反应体系的pH调至10，配置缓冲溶液时即做到，如不行再做后调整。3.用HCl 将溶液的pH调至约8.0，室温30分钟。4.在4摄氏度下，10000-13000rpm 离心 15分钟或稍长时间，收集上清液和沉淀。5.将上清液和沉淀于SDS-PAGE上样缓冲溶液混合，100 摄氏度煮沸5-10分钟，SDS-PAGE 电泳分析，观察溶解效果。以上流程可以根据实际操作，适当修改，也用6mol/L盐酸胍对包涵体 进行溶解，电泳前用透析或超滤去除掉盐酸胍。 包涵体颗粒在溶解之前当然可以机械粉碎，再加变性剂溶解，这是因为增大了反应的表面积，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失，但是目前包涵体变性后复性收率达不到30%以上，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失完全可以通过增加反应速度和溶解率来加以补偿。 |
2楼2013-04-15 14:53:02
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
|
另一个protocol: Purification of inclusion bodies and refolding of proteins http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html |
3楼2013-04-15 14:55:35
jessica_nn
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 837.6
- 散金: 2
- 帖子: 44
- 在线: 20.3小时
- 虫号: 1158390
- 注册: 2010-11-29
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2013-04-19 20:38:04
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
5楼2013-04-19 23:14:07
jessica_nn
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 837.6
- 散金: 2
- 帖子: 44
- 在线: 20.3小时
- 虫号: 1158390
- 注册: 2010-11-29
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2013-04-23 20:33:43
