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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 包涵体溶解问题
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红虫梦

新虫 (初入文坛)

[求助] 包涵体溶解问题

各位：包涵体用8M urea溶解，溶解离心之后完全不能过0.45um的滤膜，所以我觉得大部分没有溶解，而是形成了很小的颗粒。不知道有什么方法能够提高其溶解度。谢谢各位的指教！
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梦想
1楼 2012-11-14 15:20:00
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回帖置顶 ( 共有1个 )

yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2012-11-17 10:01:33
1949stone: 金币+2, 不错 2012-11-17 10:01:40
脲素溶解的样品过膜过不动是正常的，因为里面有很多杂质，有不溶解的蛋白和缓冲液的杂质。
1.你可以先离心，10000-12000rpm*10min，然后再过膜就好多了。
2.如果使用超声助溶，会使更多的目的蛋白和杂蛋白都溶解出来，对你后续纯化不利。
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5楼2012-11-16 10:31:46
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lioboo

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-11-17 10:01:21
除尿素之外再加0.06m/l tris缓冲液，7.5mm/lEDTA和1mm/lDTT，混合溶液用强剪切搅拌头搅拌
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死生挈阔与子同悦，执子之手与子偕老
2楼2012-11-14 22:04:33
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lioboo

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 红虫梦 at 2012-11-15 10:32:26
我在里面加了0.2M tris，还有5mM的巯基乙醇。我这边没有强剪切搅拌头。以前我用超声辅助溶解，但是看了很多文献从来就没有用超声的，所以就感觉是不是超声对蛋白有影响或者也不能溶解蛋白，只是形成了肉眼看不到的 ...

超声应该不行吧，应该用搅拌
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死生挈阔与子同悦，执子之手与子偕老
4楼2012-11-15 20:26:31
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qazwsxedc9328

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-11-17 10:01:49
可以用盐酸胍和DTT，看看溶解的效果。
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6楼2012-11-17 00:19:17
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lioboo

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-11-16 10:31:46
脲素溶解的样品过膜过不动是正常的，因为里面有很多杂质，有不溶解的蛋白和缓冲液的杂质。
1.你可以先离心，10000-12000rpm*10min，然后再过膜就好多了。
2.如果使用超声助溶，会使更多的目的蛋白和杂蛋白都溶解出 ...

我觉得离心不大好吧，这种情况离心肯定要用很大转速了，少量的话还可以，如果样品体积很大的话，尤其是在做中试和生产工艺时就不太现实了
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死生挈阔与子同悦，执子之手与子偕老
9楼2012-11-17 23:36:54
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lioboo

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qazwsxedc9328 at 2012-11-17 00:19:17
可以用盐酸胍和DTT，看看溶解的效果。

你可以试试透析啊
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死生挈阔与子同悦，执子之手与子偕老
10楼2012-11-17 23:39:09
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qazwsxedc9328

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以试试透析啊
我也同意这观点，而且要用氧化、还原谷胱甘肽。
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11楼2012-11-18 00:23:20
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

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★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-19 13:53:46
如果离心后还是有沉淀的话，我怀疑是你的蛋白在不断的沉淀，你可以电泳鉴定一下。
在8M脲条件下还是有沉淀，建议你使用6MGuHCl，如果担心GuHCl对后续实验有影响，你可以透析到6M脲当中。
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12楼2012-11-19 08:55:25
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普通回帖

红虫梦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lioboo at 2012-11-14 22:04:33
除尿素之外再加0.06m/l tris缓冲液，7.5mm/lEDTA和1mm/lDTT，混合溶液用强剪切搅拌头搅拌

我在里面加了0.2M tris，还有5mM的巯基乙醇。我这边没有强剪切搅拌头。以前我用超声辅助溶解，但是看了很多文献从来就没有用超声的，所以就感觉是不是超声对蛋白有影响或者也不能溶解蛋白，只是形成了肉眼看不到的小颗粒？谢谢！
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梦想
3楼2012-11-15 10:32:26
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红虫梦

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-11-16 10:31:46
脲素溶解的样品过膜过不动是正常的，因为里面有很多杂质，有不溶解的蛋白和缓冲液的杂质。
1.你可以先离心，10000-12000rpm*10min，然后再过膜就好多了。
2.如果使用超声助溶，会使更多的目的蛋白和杂蛋白都溶解出 ...

我用了18000离心了30min，还是不能过膜。有细微的沉淀离心不了。
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梦想
7楼2012-11-17 08:57:45
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红虫梦

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by qazwsxedc9328 at 2012-11-17 00:19:17
可以用盐酸胍和DTT，看看溶解的效果。

我也想这样，但是因为我后续要过阳离子交换柱，担心盐酸胍会影响上柱，所以就没有用
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梦想
8楼2012-11-17 08:58:48
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