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蛋白原核表达和包涵体纯化问题 已有2人参与
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大家好，最近在原核表达两个蛋白，一个是153AA，一个是166AA，均有信号肽，用salI和NotI酶切位点克隆进PET28A载体中，30度诱导4h, 153AA的大表有表达，大概是20KD，表达量小，估计3%，166AA的大表没有表达。 用含溶菌酶的裂解液裂解（没有超声裂解）后，发现二者主要都是包涵体表达，因为上清中很少蛋白，用8M尿素变性（变性时由于用的是1.5ml离心管做的小样，没有超声处理，所以也是溶解一部分），之后取变性的样品上清和沉淀SDS-PAGE电泳，发现二者分子量一样是14KD，很奇怪的现象,难道是提前终止了么？还是因为变性不充分，蛋白没有完全展开，但是也不至于分子量是一样，并且偏小这么多吧？大家遇到过这样的问题么？谢谢！ 对于这个现象，把诱导前的菌做了PCR鉴定，相互之间是没有污染的，并且166AA的克隆是送测序过的，所以克隆构建也没有问题。 |
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 蛋白表达纯化与检测 |
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2楼2014-08-05 10:07:24
凌波丽
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zbblpp: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-08-06 15:40:06
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| 给你个包涵体纯化、变性和复性的实验流程吧，具体你的问题改日再讨论，今天我没有时间了。 |
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2014-08-05 10:38:08, 93.73 K
3楼2014-08-05 10:31:03
4楼2014-08-05 16:18:52
5楼2014-08-06 15:41:09
6楼2014-08-06 15:45:13
7楼2014-08-07 08:39:29
salanero2000
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8楼2014-08-07 09:57:11
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谢谢您！后续验证想根据功能，是否有活性。目前看情况，感觉有活性的几率比较小。 下面是我整理了一张图片处理，这次的尿素溶解溶解的不好，但是也可以看到分子量，我在后续的实验中分子量均如此。不过今天我处理图片时，发现从这张图片看，蛋白2（166AA）的包涵体分子量好像略大那么一点点，但也在14附近，应该也有可能像您说的PAGE表观与预期分子量不符是常有的事情。 蛋白1（153AA）预测分子量是17，加上载体上的序列，20KD差不多。 蛋白1（133AA，不含信号肽），预测是15.5KD，加上载体序列差不多18. 蛋白2（166AA），预测是19.3KD，加上载体上的序列差不多应该22.这个与包涵体相差较大。 另外，最近看文献，发现有文献提到蛋白2在重组表达时可能会出现C端氨基酸丢失的现象。  细菌裂解后尿素变性跑胶---.jpg |
9楼2014-08-07 10:52:57