| 查看: 3765 | 回复: 10 | |||||
[交流]
包涵体有活性吗？
|
|||||
|
各位大侠们，我现在实验中遇到一个奇怪的问题：构建了一个重组菌，全细胞活性很高，但在细胞破碎时，不管怎么破都破不开，目标蛋白在沉淀中一坨，上清很少。怀疑过是包涵体，但是沉淀中活性居然很高。 为了确定是不是包涵体，我这几天在诱导表达时，做了一个不加IPTG诱导的对照，发现不进行诱导的很容易就破开了，破后的溶液是半透明的，同时诱导后的还是白乎乎的，跑蛋白电泳结果一样。所以应该是包涵体吧。 不知各位高人能否给些建议。谢谢啦！都纠结了两周了，还是不知道怎么办？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 实验技巧以及英语学习相关 | 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有283人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 有人知道大肠杆菌中的外源蛋白最大表达量吗
已经有6人回复
- 超声破碎细胞之后 离心转速问题
已经有15人回复
- 蛋白切胶回收如何操作？
已经有12人回复
- 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复
- pET28a载体和目的基因
已经有9人回复
- 镍柱蛋白纯化，求好心人讲解。
已经有4人回复
- 如何解决包涵体复性沉淀问题？
已经有16人回复
- T7载体的IPTG诱导
已经有10人回复
- 大肠杆菌超声破碎参数，求解！！！
已经有15人回复
- 蛋白经透析袋透析后出现浑浊，急求高手帮忙~！
已经有12人回复
- 膜蛋白表达问题
已经有15人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- 纯化后的蛋白做western，出现很明显的两条带，请问是二聚体吗？怎么打开成单体？
已经有11人回复
- 酶基因表达量高，酶活性就一定高吗？（请大家帮帮忙，谢谢）
已经有12人回复
- 这里有人研究活性炭吗，活性炭的吸附范围有哪些？
已经有17人回复
- 原核表达时裂解缓冲液的真的有裂解作用吗？
已经有4人回复
- 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
已经有17人回复
- 【求助/交流】原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶
已经有15人回复
- 【转帖】关于细菌超声破碎的一些经验总结
已经有13人回复
- 【求助/交流】含咪唑的蛋白免疫兔子
已经有11人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
- 【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？
已经有4人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
虚位以待，共探前沿：热烈欢迎报考北京工业大学纳米多孔材料课题组2026级博士研究生
+1/265
-
【CSC招生】拉瓦尔大学流体力学博士项目
+3/237
-
双一流南京医科大学招计算机、AI、统计、生物信息等方向26年9月入学博士
+1/183
-
湖南师范大学蒋乐勇教授课题组招收2026届“申请-考核”制博士生
+1/175
-
接样SEM/XPS/XRD/FTIR/BET等多种测试/提供预存服务
+1/86
-
限广州，征女友
+2/34
-
国家青年人才叶立群教授课题组招收2026级博士研究生
+1/30
-
博士后招聘
+1/27
-
中科大环境系张常勇教授课题组招聘副研/博士后（一人一议）
+1/22
-
上海大学昝鹏教授、军事医学研究院伯晓晨研究员/倪铭副研究员 课题组招聘博士生
+2/16
-
天津大学化学系吴立朋课题组申请考核制博士招生/博后招聘
+1/14
-
山东大学集成电路学院博士招生1名
+1/14
-
肿瘤免疫课题组招聘 博后
+1/13
-
海南师范大学招收化学博士（光电功能材料课题组招收博士研究生）
+1/6
-
新加坡南洋理工大学材料科学与工程学院招收博士研究生 (2026年8月入学)
+1/6
-
北京师范大学与企业联合招聘博士后、全职、兼职人员
+1/5
-
想读博士(理工/化学类/新能源材料)求大佬捞一下 ？或者师兄师姐推荐/建议博导招生信息
+1/5
-
中科院和北京工商大学招收2026博士/化学或生物背景
+1/4
-
武汉理工大学胡老师课题组招收2026年博士研究生
+1/2
-
南京大学FinTech大模型实验室招募斯坦福国际联培博士生（2026）
+1/1
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
hraikeyan: 金币+3 2013-05-20 08:48:30
kx444555: 金币+10, 解释的很清楚,这样的虫子很热心 2013-05-20 09:38:45
hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
hraikeyan: 金币+3 2013-05-20 08:48:30
kx444555: 金币+10, 解释的很清楚,这样的虫子很热心 2013-05-20 09:38:45
hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
|
楼主，你好！我有以下几点供你采纳！ 1,. 包涵体是主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。主要原因有：1）表达量过高，2）含有较高成分的含硫氨基酸，3）发酵过程中pH的影响，由于与等电点相近，较容易形成包涵体，4）重组蛋白为异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。确定是不是包涵体，你可以从这几点入手！ 2. 包涵体有活性的很少见！你可以将包涵体用你的破碎buffer多洗两遍，分别检测洗液和包涵体有没有活性！如果没有活性了，那可能就是包涵体了；如果有活性，那可能就是你的破碎buffer不合适了！我猜可能有以下问题“ 在这之前，你先将你的protein用DNAman分析一下，蛋白的性质！！！！非常重要！！！！ 1）.你的lysis buffer pH不合适，我猜可能你的蛋白pI在其附近，所以破碎之后，容易形成沉淀！但并不影响其活性！！ 2）.如果你的lysis buffer 其中不含有盐或者盐浓度很低，我猜可能你的Recombinant protein 是盐溶性蛋白！建议适当的添加盐浓度，有利于提高蛋白的溶解性！ 3）假如你的蛋白之中含有二硫键的存在，通过添加一定浓度的DTT或者beta-巯基乙醇！高的可以选择50~100mM,低的可以选择5mM！如果你需要过Ni柱纯化，可以选择1~2mM，一般的NI柱还是能承受的！还原剂可以起到一定的增溶的作用！ 4）破碎条件的优化，破碎的过程中尽量避免蛋白液体发热！！！温度的变化会使蛋白沉淀！一般选用冰水混合物冰浴破碎！并每隔5min查看一次！ 好吧，就这么多吧！希望能给你点提醒！ |
3楼2013-05-17 22:04:31
2楼2013-05-17 21:26:15
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2013-05-18 08:34:12
5楼2013-05-20 08:49:15
6楼2013-05-27 22:21:31
7楼2013-05-29 19:48:30
8楼2013-05-30 15:54:49
jianlongli9楼2015-03-27 09:22:18
10楼2015-04-05 21:38:05
11楼2015-04-05 21:39:02