| 查看: 3867 | 回复: 10 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
[交流]
包涵体有活性吗？
|
|||||
|
各位大侠们，我现在实验中遇到一个奇怪的问题：构建了一个重组菌，全细胞活性很高，但在细胞破碎时，不管怎么破都破不开，目标蛋白在沉淀中一坨，上清很少。怀疑过是包涵体，但是沉淀中活性居然很高。 为了确定是不是包涵体，我这几天在诱导表达时，做了一个不加IPTG诱导的对照，发现不进行诱导的很容易就破开了，破后的溶液是半透明的，同时诱导后的还是白乎乎的，跑蛋白电泳结果一样。所以应该是包涵体吧。 不知各位高人能否给些建议。谢谢啦！都纠结了两周了，还是不知道怎么办？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 实验技巧以及英语学习相关 | 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有203人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 有人知道大肠杆菌中的外源蛋白最大表达量吗
已经有6人回复
- 超声破碎细胞之后 离心转速问题
已经有15人回复
- 蛋白切胶回收如何操作？
已经有12人回复
- 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复
- pET28a载体和目的基因
已经有9人回复
- 镍柱蛋白纯化，求好心人讲解。
已经有4人回复
- 如何解决包涵体复性沉淀问题？
已经有16人回复
- T7载体的IPTG诱导
已经有10人回复
- 大肠杆菌超声破碎参数，求解！！！
已经有15人回复
- 蛋白经透析袋透析后出现浑浊，急求高手帮忙~！
已经有12人回复
- 膜蛋白表达问题
已经有15人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- 纯化后的蛋白做western，出现很明显的两条带，请问是二聚体吗？怎么打开成单体？
已经有11人回复
- 酶基因表达量高，酶活性就一定高吗？（请大家帮帮忙，谢谢）
已经有12人回复
- 这里有人研究活性炭吗，活性炭的吸附范围有哪些？
已经有17人回复
- 原核表达时裂解缓冲液的真的有裂解作用吗？
已经有4人回复
- 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
已经有17人回复
- 【求助/交流】原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶
已经有15人回复
- 【转帖】关于细菌超声破碎的一些经验总结
已经有13人回复
- 【求助/交流】含咪唑的蛋白免疫兔子
已经有11人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
- 【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？
已经有4人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
南方医科大学中药学院 申请考核博士一名 （天然药化方向，天然产物分离经验优先）
+1/279
-
南方科技大学周友运课题组诚聘博士后、科研助理
+1/173
-
丙烯液相
+1/78
-
“超分子材料交叉研究团队”联合诚聘博士后 [清华/吉大/复旦/北大]
+1/72
-
博后平台选择
+1/71
-
科罗拉多大学 Congjun Yu 课题组招聘
+1/32
-
山东科技大学招聘化学化工博士博士后
+1/32
-
教育部重点实验室和清华大学某国家重点实验室，联合培养硕生、博生，并长期招博士后
+1/30
-
上海市“光探测材料与器件”工程技术研究中心（上海应用技术大学）招聘优秀研究人员
+1/28
-
教育部重点实验室和清华大学某国家重点实验室，联合培养硕生、博生，并长期招博士后
+1/27
-
中国科学院上海光学精密机械研究所 特种强激光薄膜课题组
+1/25
-
上海理工大学顾敏院士、张轶楠教授团队 招聘 2026级 光学工程 博士生
+1/11
-
中山大学柔性电子学院黄维院士团队诚招柔性可穿戴电子方向博士生（2026年9月入学）
+1/10
-
太原理工大学集成电路学院院长团队招收2026年博士研究生
+1/9
-
法国斯特拉斯堡大学有机光伏全奖博士招聘
+1/6
-
南京林业大学国家级青年人才团队招收2026年生物质转化/炭材料/储能等方向博士生
+1/4
-
【博士后/科研助理招聘-北京理工大学-集成电路与电子学院-国家杰青团队】
+1/4
-
双一流联合团队招聘团队青年人才与博后
+1/2
-
澳科大诚招2026年秋季生物材料全奖博士研究生（今日16:30线上宣讲会）
+1/1
-
苏州大学医学院纳米生物医学方向招收申请考核制博士生1名
+1/1
8楼2013-05-30 15:54:49
2楼2013-05-17 21:26:15
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
hraikeyan: 金币+3 2013-05-20 08:48:30
kx444555: 金币+10, 解释的很清楚,这样的虫子很热心 2013-05-20 09:38:45
hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
hraikeyan: 金币+3 2013-05-20 08:48:30
kx444555: 金币+10, 解释的很清楚,这样的虫子很热心 2013-05-20 09:38:45
hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
|
楼主，你好！我有以下几点供你采纳！ 1,. 包涵体是主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。主要原因有：1）表达量过高，2）含有较高成分的含硫氨基酸，3）发酵过程中pH的影响，由于与等电点相近，较容易形成包涵体，4）重组蛋白为异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。确定是不是包涵体，你可以从这几点入手！ 2. 包涵体有活性的很少见！你可以将包涵体用你的破碎buffer多洗两遍，分别检测洗液和包涵体有没有活性！如果没有活性了，那可能就是包涵体了；如果有活性，那可能就是你的破碎buffer不合适了！我猜可能有以下问题“ 在这之前，你先将你的protein用DNAman分析一下，蛋白的性质！！！！非常重要！！！！ 1）.你的lysis buffer pH不合适，我猜可能你的蛋白pI在其附近，所以破碎之后，容易形成沉淀！但并不影响其活性！！ 2）.如果你的lysis buffer 其中不含有盐或者盐浓度很低，我猜可能你的Recombinant protein 是盐溶性蛋白！建议适当的添加盐浓度，有利于提高蛋白的溶解性！ 3）假如你的蛋白之中含有二硫键的存在，通过添加一定浓度的DTT或者beta-巯基乙醇！高的可以选择50~100mM,低的可以选择5mM！如果你需要过Ni柱纯化，可以选择1~2mM，一般的NI柱还是能承受的！还原剂可以起到一定的增溶的作用！ 4）破碎条件的优化，破碎的过程中尽量避免蛋白液体发热！！！温度的变化会使蛋白沉淀！一般选用冰水混合物冰浴破碎！并每隔5min查看一次！ 好吧，就这么多吧！希望能给你点提醒！ |
3楼2013-05-17 22:04:31
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2013-05-18 08:34:12