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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 超声破碎细胞之后 离心转速问题
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seebinghe

银虫 (正式写手)

[求助] 超声破碎细胞之后 离心转速问题

蛋白在膜和包涵体中都有，超声破碎之后，用多大转速离心分离比较好？新手，不知该怎么办，求各位大侠指教！
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1楼 2012-11-04 18:47:32
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seebinghe

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by rabitluan at 2012-11-08 12:46:49
膜蛋白不是要超速离心才能离下来吗？破碎后先离心12000rpm 20min，出去包涵体，然后再超速离心，150000g 1h 将膜蛋白离下来吗?不知道楼主后期是怎么做的？

150000g ？  没必要那么高吧，一般在膜上就是6000转去包涵体，在包涵体中15000g就差不多了吧，我看师兄师姐们都是真么搞的。
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12楼2012-11-08 15:55:52
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
离心的的话， 一般设定为12000RPM（或者15000g以上）以上才可，这样能保证分子量为10kD的蛋白质离心下来，但不知你的目的蛋白分子量有多大？
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2楼2012-11-04 19:58:30
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seebinghe

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by AZURESKY1999 at 2012-11-04 19:58:30
离心的的话， 一般设定为12000RPM（或者15000g以上）以上才可，这样能保证分子量为10kD的蛋白质离心下来，但不知你的目的蛋白分子量有多大？

分子量12kd左右   膜蛋白， 原核表达 膜和包涵体中都有~
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3楼2012-11-04 20:01:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:19:48
seebinghe: 金币+3, ★★★很有帮助, 多谢指教 2012-11-08 15:52:21
这要看你想从变性蛋白还是native形式的蛋白继续往下做了。高速离心的话包涵体在沉淀里面，而活性蛋白在上清里面。既然你的目的蛋白部分形成包涵体，你可以试着改变诱导条件而改变目的蛋白在包涵体中的比例，从而便于进一步分离纯化。
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4楼2012-11-05 01:11:22
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
seebinghe: 金币+1, ★有帮助, 多谢参与 2012-11-08 15:53:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by seebinghe at 2012-11-04 20:01:35
分子量12kd左右   膜蛋白， 原核表达 膜和包涵体中都有~...

不知道你的表达系统是哪一种，如果目的蛋白分子量在12kD的话，超声破碎后尝试用14000rpm离心条件，20min收集沉淀，WESTERN BLOT看是否是你所需要蛋白
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5楼2012-11-05 07:43:15
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maychao123

银虫 (小有名气)
楼主是怎么确定的膜和包涵体都有呢？不是还没分离开么？
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Don‘tforget3Oct
6楼2012-11-05 07:58:19
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mzhyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
seebinghe: 金币+1, ★有帮助 2012-11-12 08:28:31
10000-15000应该是可以的了。
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7楼2012-11-05 08:05:43
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seebinghe

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by maychao123 at 2012-11-05 07:58:19
楼主是怎么确定的膜和包涵体都有呢？不是还没分离开么？

分过一次了，用的15000rpm，跑胶显示蛋白在膜上 和包涵体中都有。那次是和一个在表达在膜上的蛋白一起离心的，结果被师姐痛骂一顿，说膜上的6000rpm就可以，转速打了膜就有些下来了。想问下膜和包涵体中都有的话，多大转速好？毕竟两者的蛋白我都要……
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8楼2012-11-05 12:40:14
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maychao123

银虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-08 13:50:26
引用回帖:
8楼: Originally posted by seebinghe at 2012-11-05 12:40:14
分过一次了，用的15000rpm，跑胶显示蛋白在膜上 和包涵体中都有。那次是和一个在表达在膜上的蛋白一起离心的，结果被师姐痛骂一顿，说膜上的6000rpm就可以，转速打了膜就有些下来了。想问下膜和包涵体中都有的话， ...

可是楼主用15000rpm离心的话膜和包涵体都会下来啊，那怎么确定是两个里面都有呢，只要有一个有就会在胶上有显示啊，实在不行你就多离心几次吧，先粗略分离膜和包涵体，然后各自在自己适合的转速下（稍微提高或降低一点转速，不怕损失，为了更好的分离）多离心几次纯化，不知道行不行。
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Don‘tforget3Oct
9楼2012-11-06 09:53:59
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by seebinghe at 2012-11-05 12:40:14
分过一次了，用的15000rpm，跑胶显示蛋白在膜上 和包涵体中都有。那次是和一个在表达在膜上的蛋白一起离心的，结果被师姐痛骂一顿，说膜上的6000rpm就可以，转速打了膜就有些下来了。想问下膜和包涵体中都有的话， ...

楼主的膜蛋白是要经过去垢剂抽提吗？
我们做膜蛋白的时候一般破碎细胞之后5000g离心15min，去掉未破碎的细胞和包涵体，再将上清拿去超速离心，4000rpm，1h左右，离心下来的就是膜了
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10楼2012-11-06 20:38:28
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