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木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】蛋白提取过程中遇到的问题与困惑

从hela细胞中提取总蛋白质，然后酶解，进行蛋白组层次的分析

   具体方法是：
   用的是pH=7.4的tris-hcl，8M尿素，加了各种的酶抑制剂，然后超声破碎细胞，破碎液离心后，上清液用有机溶剂沉淀法沉淀蛋白质。

   在这个过程中遇到的第一个问题是，1）裂解液中同时加了cocktail和PMSF，师兄说加了cocktail之后，PMSF就没有必要加了，而且cocktail用量是1%，我用了2%。究竟PMSF加不加有没有影响？？？？
   2）由于PMSF半衰期短，我是随用随加的，而且是加完之后，立刻用于超声破碎细胞。但是我发现PMSF在裂解液中没有完全溶解，大部分还沉淀在底部。这样进行超声破碎，不知道PMSF还能不能起作用？？？？
   3)我超声破碎细胞的时候，是3s/3s/60次，400w，总共180次，可是我发现裂解液还是很浑浊，裂解到240次，理解液还是很浑浊。
   请问超声次数太多，对蛋白有哪些危害？危害大么？理论上，破碎后的裂解液应该是什么情况？？？？
   4）在采用有机溶剂沉淀蛋白的时候，我是在-20℃预冷，加入后，在-20℃过夜（这个时间从12-18h不等），然后进行离心洗涤的。我看有的人说有机溶剂沉淀之后要马上离心，以获得活性蛋白。但是我要的是总蛋白，然后酶解，做蛋白组分析，应该不用保证活性把？？？？？
   5)蛋白在冻干后复溶，测定浓度的时候，一般要在4℃摇床上面溶解多久啊，我的都将近八个小时才溶解完全！
   还有，如果我没有完全溶解的情况下，就将溶解液包括不容物在-20度冻起来，等我下次使用的时候，怎么样才能使那些没有溶解的蛋白继续溶解？？？？？

问题很多，还望高手解答，谢谢！

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