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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】蛋白提取
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助】蛋白提取

请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？
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1楼 2011-04-12 11:18:00
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HarveyWang

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★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-12 11:18:00:
请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？

后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。
因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？
难道要加100 mM的HCl处理 一小时？
那菌体估计都要破掉了。


你的菌体的获得很麻烦吗？难道是生长在磷酸钙之类的上面？


菌体提取的蛋白，要分成几类：
1）最简单的，可溶性上清中的蛋白: 去除盐类后，可以做双向电泳的样品。

2）膜蛋白，因为可溶性差，需要特殊的试剂处理，增加其在第一维电泳时的可溶性。具体的你得去查论文，这里只是提示一下。

另外，实际上，对于全细胞蛋白，双向电泳许多时候会过滤掉很多蛋白点的！
选择双向电泳Loading buffer 组分很关键。
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2楼2011-04-12 17:41:10
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
谢谢！培养基中是有磷酸钙，我就是要加酸把它给溶了，时间不长，溶了之后立即离心，用缓冲液洗洗可以吗？我是想提蛋白，双向电泳找差异蛋白。直接上双向找可以吗？
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3楼2011-04-13 08:50:37
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2011-04-12 17:41:10:
后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。
因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？
难道要加100 mM的HCl处理 一小时？
那菌体估计都要破掉了。


你的菌体的获得很麻烦 ...

我直接用浓盐酸溶，可以吗
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4楼2011-04-13 09:00:21
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HarveyWang

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tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 20:28:37
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-13 09:00:21:
我直接用浓盐酸溶，可以吗

绝对不可以。
浓盐酸会溶解细胞，1min 内就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。
酸，即使50 mM HCl，也会沉淀许多细胞蛋白。

我觉得你没必要非要这时候去除磷酸钙。
你可以在破碎菌体时离心去除的。

你如果是做菌体上清蛋白，而发酵液没有其他固体培养基的话，
建议你在pH8-10之间，直接超声破碎  发酵液沉淀（就是磷酸钙+菌体），
然后在4℃ 10000 rpm  离心10-20min,
这样，磷酸钙都沉淀了，  取上清即可。

如果想溶解更多的膜蛋白（或全菌体蛋白），需要用2D电泳的Loading Buffer 加入发酵液沉淀，来直接超声破碎沉淀，然后在4℃ 10000 rpm  离心10-20min，取上清。

如果想鉴定破碎液的蛋白， 就用SDS -PAGE电泳 loading buffer, 加入样品后沸水浴3-5min，离心，上样即可。

你看如何？

[ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ]
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5楼2011-04-13 18:34:09
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2011-04-13 18:34:09:
绝对不可以。
浓盐酸会溶解细胞，1min 内就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。
酸，即使50 mM HCl，也会沉淀许多细胞蛋白。

我觉得你没必要非要这时候去除磷酸钙。
你可以在破碎菌体时离心去除 ...

不得不说你真的很厉害，分析的很详细！谢谢！现在问题是我找差异蛋白应该是提菌体蛋白，好像是将菌液离心，去上清，再用缓冲液重悬，然后直接硫酸铵沉淀蛋白，这过程中哪儿能去掉磷酸钙呢？还有，我那个菌产酸，培养一天后pH值就已经是3点几了，是不是已经不能提蛋白了？劳烦您再给说说，O(∩_∩)O谢谢
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6楼2011-04-13 20:47:54
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HarveyWang

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tangchaoxi(金币+2): 2011-05-25 09:50:40
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-13 20:47:54:
不得不说你真的很厉害，分析的很详细！谢谢！现在问题是我找差异蛋白应该是提菌体蛋白，好像是将菌液离心，去上清，再用缓冲液重悬，然后直接硫酸铵沉淀蛋白，这过程中哪儿能去掉磷酸钙呢？还有，我那个菌产酸， ...

1)既然是找菌体差异蛋白，那应该是全菌体蛋白。 怎么是用硫酸铵来沉淀菌体蛋白呢？

全菌体蛋白的提取就是用 2D电泳的 Loading buffer （里面主要的是尿素或硫脲，还有些非离子表面活性剂等等。。这要看你的优化条件）。

你分离出细胞就可以了。不需要硫酸铵沉淀蛋白，再说硫酸铵沉淀蛋白不可能时完全的，对于你找群体差异蛋白造成很大干扰。

按照你的情况，发酵液离心得到磷酸钙和菌体沉淀，然后用缓冲液重悬，再离心沉淀，然后就加蛋白提取液 。（2D电泳膜蛋白提取 好像也有试剂盒的，比较贵些。。。你也可以选择最近的文献中 全细胞提取 尤其是膜蛋白提取的配方）


2）菌体产酸 对全菌体蛋白提取过程不会有什么影响。

因为你要发酵液离心（1 mL 发酵液足够了），然后用4℃  0.9% NaCl 洗涤一下，再离心，直接加 全菌体蛋白提取液。

离心机最好选用高速的。例如 10000 rpm--30 sec 就基本可以离心下菌体细胞了。这个洗涤过程操作也就1-2min时间。
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7楼2011-04-14 07:34:12
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