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【求助】蛋白提取
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| 请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？ |
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amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
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后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。 因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？ 难道要加100 mM的HCl处理 一小时？ 那菌体估计都要破掉了。 你的菌体的获得很麻烦吗？难道是生长在磷酸钙之类的上面？ 菌体提取的蛋白，要分成几类： 1）最简单的，可溶性上清中的蛋白: 去除盐类后，可以做双向电泳的样品。 2）膜蛋白，因为可溶性差，需要特殊的试剂处理，增加其在第一维电泳时的可溶性。具体的你得去查论文，这里只是提示一下。 另外，实际上，对于全细胞蛋白，双向电泳许多时候会过滤掉很多蛋白点的！ 选择双向电泳Loading buffer 组分很关键。 |
2楼2011-04-12 17:41:10
3楼2011-04-13 08:50:37
4楼2011-04-13 09:00:21
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 20:28:37
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绝对不可以。 浓盐酸会溶解细胞，1min 内就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。 酸，即使50 mM HCl，也会沉淀许多细胞蛋白。 我觉得你没必要非要这时候去除磷酸钙。 你可以在破碎菌体时离心去除的。 你如果是做菌体上清蛋白，而发酵液没有其他固体培养基的话， 建议你在pH8-10之间，直接超声破碎 发酵液沉淀（就是磷酸钙+菌体）， 然后在4℃ 10000 rpm 离心10-20min, 这样，磷酸钙都沉淀了， 取上清即可。 如果想溶解更多的膜蛋白（或全菌体蛋白），需要用2D电泳的Loading Buffer 加入发酵液沉淀，来直接超声破碎沉淀，然后在4℃ 10000 rpm 离心10-20min，取上清。 如果想鉴定破碎液的蛋白， 就用SDS -PAGE电泳 loading buffer, 加入样品后沸水浴3-5min，离心，上样即可。 你看如何？ [ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ] |
5楼2011-04-13 18:34:09
6楼2011-04-13 20:47:54
tangchaoxi(金币+2): 2011-05-25 09:50:40
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1)既然是找菌体差异蛋白，那应该是全菌体蛋白。 怎么是用硫酸铵来沉淀菌体蛋白呢？ 全菌体蛋白的提取就是用 2D电泳的 Loading buffer （里面主要的是尿素或硫脲，还有些非离子表面活性剂等等。。这要看你的优化条件）。 你分离出细胞就可以了。不需要硫酸铵沉淀蛋白，再说硫酸铵沉淀蛋白不可能时完全的，对于你找群体差异蛋白造成很大干扰。 按照你的情况，发酵液离心得到磷酸钙和菌体沉淀，然后用缓冲液重悬，再离心沉淀，然后就加蛋白提取液 。（2D电泳膜蛋白提取 好像也有试剂盒的，比较贵些。。。你也可以选择最近的文献中 全细胞提取 尤其是膜蛋白提取的配方） 2）菌体产酸 对全菌体蛋白提取过程不会有什么影响。 因为你要发酵液离心（1 mL 发酵液足够了），然后用4℃ 0.9% NaCl 洗涤一下，再离心，直接加 全菌体蛋白提取液。 离心机最好选用高速的。例如 10000 rpm--30 sec 就基本可以离心下菌体细胞了。这个洗涤过程操作也就1-2min时间。 |
7楼2011-04-14 07:34:12