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[交流]
【求助】蛋白提取
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| 请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？ |
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tangchaoxi(金币+2): 2011-05-25 09:50:40
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1)既然是找菌体差异蛋白，那应该是全菌体蛋白。 怎么是用硫酸铵来沉淀菌体蛋白呢？ 全菌体蛋白的提取就是用 2D电泳的 Loading buffer （里面主要的是尿素或硫脲，还有些非离子表面活性剂等等。。这要看你的优化条件）。 你分离出细胞就可以了。不需要硫酸铵沉淀蛋白，再说硫酸铵沉淀蛋白不可能时完全的，对于你找群体差异蛋白造成很大干扰。 按照你的情况，发酵液离心得到磷酸钙和菌体沉淀，然后用缓冲液重悬，再离心沉淀，然后就加蛋白提取液 。（2D电泳膜蛋白提取 好像也有试剂盒的，比较贵些。。。你也可以选择最近的文献中 全细胞提取 尤其是膜蛋白提取的配方） 2）菌体产酸 对全菌体蛋白提取过程不会有什么影响。 因为你要发酵液离心（1 mL 发酵液足够了），然后用4℃ 0.9% NaCl 洗涤一下，再离心，直接加 全菌体蛋白提取液。 离心机最好选用高速的。例如 10000 rpm--30 sec 就基本可以离心下菌体细胞了。这个洗涤过程操作也就1-2min时间。 |
7楼2011-04-14 07:34:12
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amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
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后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。 因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？ 难道要加100 mM的HCl处理 一小时？ 那菌体估计都要破掉了。 你的菌体的获得很麻烦吗？难道是生长在磷酸钙之类的上面？ 菌体提取的蛋白，要分成几类： 1）最简单的，可溶性上清中的蛋白: 去除盐类后，可以做双向电泳的样品。 2）膜蛋白，因为可溶性差，需要特殊的试剂处理，增加其在第一维电泳时的可溶性。具体的你得去查论文，这里只是提示一下。 另外，实际上，对于全细胞蛋白，双向电泳许多时候会过滤掉很多蛋白点的！ 选择双向电泳Loading buffer 组分很关键。 |
2楼2011-04-12 17:41:10
3楼2011-04-13 08:50:37
4楼2011-04-13 09:00:21
