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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】蛋白提取
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助】蛋白提取

请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？
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1楼 2011-04-12 11:18:00
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2011-04-13 18:34:09:
绝对不可以。
浓盐酸会溶解细胞，1min 内就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。
酸，即使50 mM HCl，也会沉淀许多细胞蛋白。

我觉得你没必要非要这时候去除磷酸钙。
你可以在破碎菌体时离心去除 ...

不得不说你真的很厉害，分析的很详细！谢谢！现在问题是我找差异蛋白应该是提菌体蛋白，好像是将菌液离心，去上清，再用缓冲液重悬，然后直接硫酸铵沉淀蛋白，这过程中哪儿能去掉磷酸钙呢？还有，我那个菌产酸，培养一天后pH值就已经是3点几了，是不是已经不能提蛋白了？劳烦您再给说说，O(∩_∩)O谢谢
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6楼2011-04-13 20:47:54
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-12 11:18:00:
请问下酸会影响提细菌蛋白吗？因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外，提出的蛋白可以直接双向电泳吗？

后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。
因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？
难道要加100 mM的HCl处理 一小时？
那菌体估计都要破掉了。


你的菌体的获得很麻烦吗？难道是生长在磷酸钙之类的上面？


菌体提取的蛋白，要分成几类：
1）最简单的，可溶性上清中的蛋白: 去除盐类后，可以做双向电泳的样品。

2）膜蛋白，因为可溶性差，需要特殊的试剂处理，增加其在第一维电泳时的可溶性。具体的你得去查论文，这里只是提示一下。

另外，实际上，对于全细胞蛋白，双向电泳许多时候会过滤掉很多蛋白点的！
选择双向电泳Loading buffer 组分很关键。
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2楼2011-04-12 17:41:10
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
谢谢！培养基中是有磷酸钙，我就是要加酸把它给溶了，时间不长，溶了之后立即离心，用缓冲液洗洗可以吗？我是想提蛋白，双向电泳找差异蛋白。直接上双向找可以吗？
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3楼2011-04-13 08:50:37
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2011-04-12 17:41:10:
后面看到，你的蛋白是用来做双向电泳的，而不是测活的。
因此，低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少？
难道要加100 mM的HCl处理 一小时？
那菌体估计都要破掉了。


你的菌体的获得很麻烦 ...

我直接用浓盐酸溶，可以吗
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4楼2011-04-13 09:00:21
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