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[交流]
【求助】蛋白提取
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| 请问下酸会影响提细菌蛋白吗?因为我需要将培养基中的难溶磷用酸溶掉才能得到菌体。谢谢。另外,提出的蛋白可以直接双向电泳吗? |
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tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 20:28:37
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绝对不可以。 浓盐酸会溶解细胞,1min 内就溶解了,然后大部分蛋白被酸沉。 酸,即使50 mM HCl,也会沉淀许多细胞蛋白。 我觉得你没必要非要这时候去除磷酸钙。 你可以在破碎菌体时离心去除的。 你如果是做菌体上清蛋白,而发酵液没有其他固体培养基的话, 建议你在pH8-10之间,直接超声破碎 发酵液沉淀(就是磷酸钙+菌体), 然后在4℃ 10000 rpm 离心10-20min, 这样,磷酸钙都沉淀了, 取上清即可。 如果想溶解更多的膜蛋白(或全菌体蛋白),需要用2D电泳的Loading Buffer 加入发酵液沉淀,来直接超声破碎沉淀,然后在4℃ 10000 rpm 离心10-20min,取上清。 如果想鉴定破碎液的蛋白, 就用SDS -PAGE电泳 loading buffer, 加入样品后沸水浴3-5min,离心,上样即可。 你看如何? [ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ] |
5楼2011-04-13 18:34:09
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金币+3): 2011-04-13 08:45:56
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后面看到,你的蛋白是用来做双向电泳的,而不是测活的。 因此,低pH的酸应该影响不到蛋白吧。 关键是你加酸量有多少? 难道要加100 mM的HCl处理 一小时? 那菌体估计都要破掉了。 你的菌体的获得很麻烦吗?难道是生长在磷酸钙之类的上面? 菌体提取的蛋白,要分成几类: 1)最简单的,可溶性上清中的蛋白: 去除盐类后,可以做双向电泳的样品。 2)膜蛋白,因为可溶性差,需要特殊的试剂处理,增加其在第一维电泳时的可溶性。具体的你得去查论文,这里只是提示一下。 另外,实际上,对于全细胞蛋白,双向电泳许多时候会过滤掉很多蛋白点的! 选择双向电泳Loading buffer 组分很关键。 |
2楼2011-04-12 17:41:10
3楼2011-04-13 08:50:37
4楼2011-04-13 09:00:21













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