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coffee159

金虫 (小有名气)

[求助] 包涵体的洗涤 已有3人参与

高手们,本人是准研一的,刚进实验室做实验。现在在做重组基因的原核表达,超声破碎细胞后用洗涤液洗包涵体,是洗掉一些膜碎片和膜蛋白吗?为什么每次洗过之后的上清和沉淀都要制样跑SDS-PAGE呢?还有,为什么包涵体跑电泳时会出现好多条带?谢谢你们了。
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-08-04 00:08:51
coffee159: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-04 08:59:42
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白,每次跑胶是为了检测你目的蛋白,及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带,有可能是不纯,如果你没过柱,多条带是很正常的,如果过柱纯化,而且个方面都没问题的话,就考虑一下是否是二聚体和多聚体(如果你蛋白中含多个半胱氨酸的话,很有可能)。Good luck!
互助互励,共奋共进!!
2楼2013-08-03 21:45:19
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coffee159

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-03 21:45:19
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白,每次跑胶是为了检测你目的蛋白,及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带,有可能是不纯,如果你没过柱,多条带是很正常的,如果过柱纯化,而且个方 ...

谢谢你,还有点不明白,洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白?还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白,那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢?
3楼2013-08-04 09:02:48
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by coffee159 at 2013-08-04 09:02:48
谢谢你,还有点不明白,洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白?还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白,那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢?...

包涵体是复合体,其顽固程度不同,在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散,溶解!
互助互励,共奋共进!!
4楼2013-08-04 09:10:33
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coffee159

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 09:10:33
包涵体是复合体,其顽固程度不同,在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散,溶解!...

谢谢了啊
5楼2013-08-04 10:47:04
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马海云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 09:10:33
包涵体是复合体,其顽固程度不同,在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散,溶解!...

你好,要是包涵体洗过之后,要想检验是否洗干净,我跑蛋白胶,怎样的结果是说明我洗干净了呢?
6楼2014-07-18 09:58:40
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王小蒙602

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

目标条带纯度越高,就说明洗得约感觉啊
7楼2014-07-18 14:45:18
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 马海云 at 2014-07-18 09:58:40
你好,要是包涵体洗过之后,要想检验是否洗干净,我跑蛋白胶,怎样的结果是说明我洗干净了呢?...

洗后,上清拿去跑胶,如果上清基本没蛋白了就说明差不错了,但实际意义不大。因为,洗涤后最终还是要过柱才能得到纯蛋白。
互助互励,共奋共进!!
8楼2014-07-19 04:16:08
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马海云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Sthunder at 2014-07-19 04:16:08
洗后,上清拿去跑胶,如果上清基本没蛋白了就说明差不错了,但实际意义不大。因为,洗涤后最终还是要过柱才能得到纯蛋白。...

奥,这个我是知道的,可是我的最终沉淀跑胶发现杂带还是很多,每次洗涤的上清跑胶发现根本没有东西,这是什么原因呢?
9楼2014-07-21 08:46:56
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马海云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 王小蒙602 at 2014-07-18 14:45:18
目标条带纯度越高,就说明洗得约感觉啊

我的是洗过之后还是有杂带,没找到原因呢
10楼2014-07-21 08:48:56
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