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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 包涵体的洗涤
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coffee159

金虫 (小有名气)

[求助] 包涵体的洗涤 已有3人参与

高手们，本人是准研一的，刚进实验室做实验。现在在做重组基因的原核表达，超声破碎细胞后用洗涤液洗包涵体，是洗掉一些膜碎片和膜蛋白吗？为什么每次洗过之后的上清和沉淀都要制样跑SDS-PAGE呢？还有，为什么包涵体跑电泳时会出现好多条带？谢谢你们了。
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1楼 2013-08-03 20:40:27
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-04 00:08:51
coffee159: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-04 08:59:42
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白，每次跑胶是为了检测你目的蛋白，及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带，有可能是不纯，如果你没过柱，多条带是很正常的，如果过柱纯化，而且个方面都没问题的话，就考虑一下是否是二聚体和多聚体（如果你蛋白中含多个半胱氨酸的话，很有可能）。Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
2楼2013-08-03 21:45:19
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-03 21:45:19
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白，每次跑胶是为了检测你目的蛋白，及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带，有可能是不纯，如果你没过柱，多条带是很正常的，如果过柱纯化，而且个方 ...

谢谢你，还有点不明白，洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白？还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白，那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢？
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3楼2013-08-04 09:02:48
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by coffee159 at 2013-08-04 09:02:48
谢谢你，还有点不明白，洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白？还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白，那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢？...

包涵体是复合体，其顽固程度不同，在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散，溶解！
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4楼2013-08-04 09:10:33
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 09:10:33
包涵体是复合体，其顽固程度不同，在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散，溶解！...

谢谢了啊
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5楼2013-08-04 10:47:04
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马海云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 09:10:33
包涵体是复合体，其顽固程度不同，在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散，溶解！...

你好，要是包涵体洗过之后，要想检验是否洗干净，我跑蛋白胶，怎样的结果是说明我洗干净了呢？
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6楼2014-07-18 09:58:40
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王小蒙602

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

目标条带纯度越高，就说明洗得约感觉啊
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7楼2014-07-18 14:45:18
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 马海云 at 2014-07-18 09:58:40
你好，要是包涵体洗过之后，要想检验是否洗干净，我跑蛋白胶，怎样的结果是说明我洗干净了呢？...

洗后，上清拿去跑胶，如果上清基本没蛋白了就说明差不错了，但实际意义不大。因为，洗涤后最终还是要过柱才能得到纯蛋白。
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8楼2014-07-19 04:16:08
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马海云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Sthunder at 2014-07-19 04:16:08
洗后，上清拿去跑胶，如果上清基本没蛋白了就说明差不错了，但实际意义不大。因为，洗涤后最终还是要过柱才能得到纯蛋白。...

奥，这个我是知道的，可是我的最终沉淀跑胶发现杂带还是很多，每次洗涤的上清跑胶发现根本没有东西，这是什么原因呢？
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9楼2014-07-21 08:46:56
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马海云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 王小蒙602 at 2014-07-18 14:45:18
目标条带纯度越高，就说明洗得约感觉啊

我的是洗过之后还是有杂带，没找到原因呢
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10楼2014-07-21 08:48:56
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