| 查看: 4289 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
求调剂
已经有3人回复
-
265求调剂
已经有4人回复
-
085700资源与环境308求调剂
已经有6人回复
-
一志愿吉林大学材料学硕321求调剂
已经有12人回复
-
286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！
已经有3人回复
-
329求调剂
已经有5人回复
-
申请回稿延期一个月，编辑同意了。但系统上的时间没变，给编辑又写邮件了，没回复
已经有4人回复
-
材料学硕318求调剂
已经有5人回复
-
一志愿中国海洋大学，生物学，301分，求调剂
已经有6人回复
-
081700化工学硕调剂
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
福建农林大学材料工程学院高分子材料课题组招生
+1/99
-
飘在美国，有点想家
+1/53
-
PBAT溶解做成乳液
+1/40
-
西北工业大学光子学研究团队诚聘博士后！
+2/32
-
上海交通大学电催化方向博后招聘-有锂电、高分子、燃料电池背景者优先
+1/31
-
---大龄的未婚男找结婚女对象
+1/20
-
湖南大学微生物结构与功能实验室2026年计划招收博士研究生
+1/20
-
【深圳理工大学】院士工作站招聘博士后-电催化和有机电化学
+1/16
-
【2026考研调剂】南方科技大学-深圳理工大学联培 086000 免疫方向(26.9入学)
+1/16
-
武汉纺织大学纺织纤维及制品教育部重点实验室招收博士研究生
+1/14
-
【2026博士招生/博后招聘】北京航空航天大学潘彪课题组——AI芯片设计方向
+1/11
-
211/双一流---石河子大学---有机化学方向招调剂生
+1/8
-
中国民航飞行学院先进连接团队招收航空宇航、航空机械专业硕士研究生（学硕专硕均可）
+1/7
-
华中科技大学管理学院招聘社会用工（科研助理）1名
+1/6
-
26年申博自荐-计算机视觉
+1/6
-
南京林业大学化学工程学院柏惺峰课题组招收2026年申请考核制博士2名
+1/6
-
125603工业工程与管理调剂
+1/2
-
国家杰青低维材料与器件力学团队2026年招收博士研究生
+1/2
-
巴塞罗那自治大学（UAB）-巴塞罗那材料研究所（ICMAB）招收博士研究生
+1/2
-
三峡大学 招收力学专业调剂生 要求过国家线 土木/水利/材料均可报
+1/1
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
|
楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。 |
5楼2012-04-17 09:50:35
3楼2012-04-16 16:18:17
11楼2012-04-18 08:31:07
4楼2012-04-17 08:34:07
6楼2012-04-17 10:37:57
★ ★
silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
|
有个问题你应该明白，没有那个蛋白用250mM洗脱的时候一点都没有，只会说需要500mM更好，但是250绝对是有的，对吧。 akta上出来的峰绝对是拖的， 绝对没有只有在500mM下来，而在250没有的蛋白。 第二载量不是问题，因为我是2ml介质，不可能就那么点蛋白。 第四，你做过需要500-1M才洗脱的重组6his蛋白？ 实际的，不提理论上。就算你要提理论，请基于你的实验数据推测。 另外我告诉你，不管哪家大公司的protocol没有强调用500-1M的咪唑的，不信你拿一个大的公司的protocol欣赏下。 [ Last edited by biowandy on 2012-4-18 at 08:26 ] |
7楼2012-04-17 11:38:46
8楼2012-04-17 19:00:42
9楼2012-04-17 19:09:07
10楼2012-04-17 19:10:42
12楼2012-05-24 12:48:25
13楼2012-05-24 14:44:13
14楼2012-11-13 09:34:47
15楼2014-01-15 10:29:13
16楼2014-07-09 11:09:44
17楼2016-11-21 21:53:34
18楼2019-12-09 14:21:18
