| 查看: 4380 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
288求调剂
已经有14人回复
-
一志愿厦大生物学332求调剂
已经有7人回复
-
085600，321分求调剂
已经有17人回复
-
一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂
已经有16人回复
-
材料化工总分334求调剂
已经有11人回复
-
288求调剂，一志愿华南理工大学071005
已经有13人回复
-
复试调剂，一志愿郑州大学材料与化工289分
已经有20人回复
-
一志愿中科大070300化学，314分求调剂
已经有4人回复
-
285求调剂
已经有9人回复
-
材料调剂
已经有7人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
★★热帖★★上岸倒计时0860生物与医药-河北大学化学与材料科学学院祝你成功上岸！
+2/180
-
2026秋季全奖港博招生：硬件安全 / 芯片设计 / AI算力方向博士招生
+1/87
-
青岛农业大学海洋学院招调剂硕士研究生【还有调剂名额】
+1/51
-
河南工业大学化学化工学院 2026 年硕士调剂火热正在进行中
+1/41
-
【紧急招生】大连工业大学唐晶晶招收2026级化学/化工类调剂硕士生（最后一天）
+1/39
-
科研助理（RA）招聘｜适合想做芯片/架构/硬件安全方向的同学（地点：深圳理工大学）
+1/39
-
西安工程大学材料学院杨杰课题组招收考研调剂生
+1/35
-
台州学院医药化工学院2026年化学/化学工程硕士调剂研究生
+1/21
-
北京理工大学（珠海）招收2026级考核制博士
+1/21
-
2026年招化学、材料、化工等专业调剂硕士生！初试可不考数学！
+1/21
-
抗病毒性传染病创新药物全国重点实验室—接收化学、生物、药学、生物与医药调剂考生
+1/20
-
【博士招生】武汉科技大学招收材料、化工、环境、冶金类2026年“申请-考核”制博士生
+1/20
-
新出名额：欢迎药学、生物、人工智能、计算机等有班长团支书经历加入-上海
+1/11
-
河北大学招收生物与医药专业调剂考生
+1/8
-
河南理工大学化学化工学院招收材料、化工类专业调剂研究生
+1/7
-
【#上海调剂急录#】能接受985联合培养的速来！带你发一区文章！
+1/5
-
湖南大学白玉罡课题组招收2026年入学博士生（第二批补录）
+1/4
-
齐齐哈尔大学李莉课题组诚招2026级考研调剂生（学硕和专硕）
+1/3
-
哈尔滨医科大学李老师课题组招收生物信息学方向博士、硕士研究生
+1/2
-
2026年鲁东大学水产专业考研调剂-滨海生态高等研究院
+1/1
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
|
楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。 |
5楼2012-04-17 09:50:35
3楼2012-04-16 16:18:17
11楼2012-04-18 08:31:07
4楼2012-04-17 08:34:07
6楼2012-04-17 10:37:57
★ ★
silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
|
有个问题你应该明白，没有那个蛋白用250mM洗脱的时候一点都没有，只会说需要500mM更好，但是250绝对是有的，对吧。 akta上出来的峰绝对是拖的， 绝对没有只有在500mM下来，而在250没有的蛋白。 第二载量不是问题，因为我是2ml介质，不可能就那么点蛋白。 第四，你做过需要500-1M才洗脱的重组6his蛋白？ 实际的，不提理论上。就算你要提理论，请基于你的实验数据推测。 另外我告诉你，不管哪家大公司的protocol没有强调用500-1M的咪唑的，不信你拿一个大的公司的protocol欣赏下。 [ Last edited by biowandy on 2012-4-18 at 08:26 ] |
7楼2012-04-17 11:38:46
8楼2012-04-17 19:00:42
9楼2012-04-17 19:09:07
10楼2012-04-17 19:10:42
12楼2012-05-24 12:48:25
13楼2012-05-24 14:44:13
14楼2012-11-13 09:34:47
15楼2014-01-15 10:29:13
16楼2014-07-09 11:09:44
17楼2016-11-21 21:53:34
18楼2019-12-09 14:21:18
