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[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
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最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
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 重组蛋白纯化 |
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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
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我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
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楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。 |
5楼2012-04-17 09:50:35
3楼2012-04-16 16:18:17
11楼2012-04-18 08:31:07
4楼2012-04-17 08:34:07
6楼2012-04-17 10:37:57
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silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
silicare: 金币+2, 把第三条删掉吧，都是做过实验才过来交流估计小木虫就没人了 2012-04-17 13:10:05
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有个问题你应该明白，没有那个蛋白用250mM洗脱的时候一点都没有，只会说需要500mM更好，但是250绝对是有的，对吧。 akta上出来的峰绝对是拖的， 绝对没有只有在500mM下来，而在250没有的蛋白。 第二载量不是问题，因为我是2ml介质，不可能就那么点蛋白。 第四，你做过需要500-1M才洗脱的重组6his蛋白？ 实际的，不提理论上。就算你要提理论，请基于你的实验数据推测。 另外我告诉你，不管哪家大公司的protocol没有强调用500-1M的咪唑的，不信你拿一个大的公司的protocol欣赏下。 [ Last edited by biowandy on 2012-4-18 at 08:26 ] |
7楼2012-04-17 11:38:46
8楼2012-04-17 19:00:42
9楼2012-04-17 19:09:07
10楼2012-04-17 19:10:42
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