| 查看: 4388 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
269求调剂
已经有6人回复
-
297求调剂
已经有20人回复
-
297求调剂
已经有28人回复
-
267求调剂
已经有5人回复
-
考研调剂
已经有6人回复
-
314求调剂
已经有9人回复
-
285求调剂
已经有7人回复
-
一志愿矿大，材料工程专硕314分，0856可调都可以
已经有10人回复
-
还有化工二轮调剂的学校吗
已经有31人回复
-
一志愿211 0703化学 346分求调剂
已经有15人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
安徽农业大学李亚辉教授诚招 化学、农药学、植保类研究生，接收调剂
+5/529
-
重庆长江师范学院材料工程接收材料类和机械类考生调剂硕士研究生
+1/175
-
★★爆★★0860生物与医药调剂考生看过来，河北大学化学与材料科学学院
+2/152
-
★★精品★★0860生物与医药还有调剂指标，最后的机会，捡漏上岸
+1/132
-
济南大学前沿交叉科学研究院2026年化学/化工专业硕士研究生调剂招生
+1/91
-
【调剂信息】山东科技大学（青岛校区）材料助剂研究团队招收调剂硕士研究生
+1/89
-
江西理工大学碳材料与新能源课题组招收2026年调剂生（学硕硕博连读）
+1/87
-
招收2026级公共卫生与预防医学专业（学硕）调剂生1名
+1/42
-
湖北大学生科院邢琼老师课题组招硕士/博士,目前还有调剂名额！
+1/40
-
山西大学光量子技术与器件国家实验室招收物理、光学、材料专业2026级博士、硕士研究生
+1/40
-
延安大学化学与化工学院接收调剂生（化学、化工学硕和材料与化工专硕）
+5/20
-
北华大学林产化学加工工程学硕和材料与化工专硕调剂招生
+1/11
-
大连大学-六盘水师范学院联合培养接收调剂
+1/10
-
招调剂_北京农学院_植物保护系_昆虫方向_专硕_学硕各1名
+1/6
-
英国拉夫堡大学博士招生 电池方向
+1/5
-
延安大学化学与化工学院接收化学专业调剂生（工科、理学均可调剂）
+5/5
-
杭州师范大学-浙江省湿地智慧监测与生态修复重点实验室团队硕士调剂公告
+1/5
-
考研调剂
+1/5
-
浙江科技大学 招 高分子材料背景调剂生
+1/3
-
河南城建学院生命科学与工程学院（085700资源与环境方向）现有调剂名额，欢迎调剂咨询
+1/2
4楼2012-04-17 08:34:07
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
3楼2012-04-16 16:18:17
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
|
楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。 |
5楼2012-04-17 09:50:35
