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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？已有1人参与

大家好，我实验过程中需要做几个抗体（这些是一抗），向老外咨询制作过程，回信说
The best is to subclone the hydrophilic loop of A proteins or cytoplasmic region of B proteins, express in the E. coli with His-tag, purify the protein and send it for immunization in Rabbit or Rat or Mouse.
因为我做的是两大类蛋白，姑且以A和B代替。
我看老外的意思是要我分别克隆一段特殊的序列（这个序列我知道，就是我的蛋白的其中一段），然后加上 His-tag（组氨酸标签）在E. coli 中表达，然后再提取纯化蛋白后在兔子或老鼠中获得抗体？
这中间有个问题，怎么加上 His-tag（组氨酸标签）？是直接设计引物引进 His-tag（组氨酸标签），还是按照有些人说的转到PET-30a这样还有 His-tag（组氨酸标签）的载体上获得？

请问有没有同学做过加 His-tag（组氨酸标签）的实验啊，请指教啊！

[ Last edited by silicare on 2014-3-28 at 14:03 ]
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1楼2012-12-08 18:23:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

alarace

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把要表达的序列克隆到比如pET系列载体中，这系列表达载体带有组氨酸标签。
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5楼2012-12-10 08:35:35
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muchong5577

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shizishanshang: 金币+5, ★★★很有帮助, 多谢，我研究载体图谱后再交流啊 2012-12-10 13:56:58
6楼的方法不对。
pET系列的载体有些是专门能提供某些标签的融合表达，如pET30a，多克隆位点上从上到下分别有His-Tag、S-Tag、His-Tag。在每个这些标签的中间都有酶切位点，如果你表达的蛋白想带上某个标签，你只要根据质粒图谱设计引物就行，不需要在引物上加所带标签的序列，简而言之，就是利用载体本身的标签。比如，你想使用pET30a带上His-Taq，你的上游引物可设计从5端有NdeI 的酶切位点，下游引物设计为S-Tag标签后，His-Tag标签前这段序列中有的酶切位点，不过建议还是采用XhoI ，因为这样表达出蛋白最短。另外要注意的是，引物设计的时候要考虑到翻译，不要造成移码突变。
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7楼2012-12-10 11:24:53
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与，欢迎常来 2012-12-10 08:10:32
都可以，只要表达的蛋白带His就可以了，有了这个标签是为了方便纯化。
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静心做事。
2楼2012-12-08 21:21:01
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 列点你所说的文献就更好了 2012-12-10 08:09:40
最近要做这方面的东西，看过的文献是直接用引物的，自己木有尝试过
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
3楼2012-12-09 11:15:12
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-12-09 11:15:12
最近要做这方面的东西，看过的文献是直接用引物的，自己木有尝试过

有没有类似的文献？介绍几个我看看？谢谢了
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-09 22:21:32
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juanzi7229

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们都是通过设计引物的方式，反向引物在终止密码子前加上6个ATG就行了，这样既方便蛋白表达后的纯化，也方便检测是否成功表达。
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6楼2012-12-10 10:12:45
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
7楼说的没错，你可以查查pET系列的载体，30a、28a什么的都是挺长用的。成功率也高。
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8楼2012-12-10 13:15:02
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zhonglin88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by muchong5577 at 2012-12-10 11:24:53
6楼的方法不对。
pET系列的载体有些是专门能提供某些标签的融合表达，如pET30a，多克隆位点上从上到下分别有His-Tag、S-Tag、His-Tag。在每个这些标签的中间都有酶切位点，如果你表达的蛋白想带上某个标签，你只要 ...

你好，我想知道，我用的是pET28a，酶切位点时SacI和HindIII，表达的蛋白会带上His标签么？
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9楼2014-03-27 19:51:18
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muchong5577

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhonglin88 at 2014-03-27 19:51:18
你好，我想知道，我用的是pET28a，酶切位点时SacI和HindIII，表达的蛋白会带上His标签么？...

带有
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10楼2014-03-28 13:54:56
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