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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » His tag真核细胞蛋白纯化
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hsya720

新虫 (初入文坛)

[交流] His tag真核细胞蛋白纯化 已有8人参与

求各位大神，我想在真核细胞HEK293中过表达带His标签的重组蛋白，然后通过镍柱过柱子纯化蛋白，测酶活性。有没有知道该怎么破碎真核细胞提取蛋白啊，用超声破碎还是裂解液？裂解液的成分会不会对过柱子有影响啊？谢谢各位了。
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1楼 2014-05-03 17:23:15
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for5

木虫 (正式写手)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-03 20:05:10
都可以的。不过你确定不是表达在上清么?鉴定没?上清和细胞裂解液做下wb。如果在胞内的话，那才多少点蛋白，你要收多少细胞才能纯化?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
2楼2014-05-03 17:55:45
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
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真核HEK293瞬时转染是常做的实验，其实纯化算是比原核简单的吧，破碎也可以超声也可以加细胞裂解液，不像包涵体比较复杂，而且真核表达 上清几率高而且活性有保障~
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
9楼2015-11-10 13:38:04
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zhang001zh

银虫 (小有名气)
★
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真核细胞破碎很容易的，可以直接用低渗溶液加去污剂快速破碎，稍微用超声辅助降低下溶液粘度就好了。
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10楼2015-11-12 13:37:44
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hsya720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-05-03 17:55:45
都可以的。不过你确定不是表达在上清么?鉴定没?上清和细胞裂解液做下wb。如果在胞内的话，那才多少点蛋白，你要收多少细胞才能纯化?

我确定是在细胞内表达的，确实是量比较小，我想先用10大皿左右的细胞试一次，我听说裂解液中的EDTA会影响柱子的吸附，所以想用超声破碎的方法，但是不知道超声破碎要用的时间，频率？
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3楼2014-05-03 18:16:15
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heylixing

铁虫 (正式写手)
★
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20-40%的功率，超声8s，停8s，超声总时间10min。我当时超声大肠用的。注意冰浴冷却。EDTA是会影响镍柱。尽量不要用。
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4楼2014-05-04 22:02:30
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做原核时候，就是裂解液和超声破碎一起的，我觉得一起i较好，双管齐下吧，楼主好好考虑，破碎太剧烈，也不好。10min，超神5s,停10s吧。60%功率。真核的楼主试着摸索下
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
5楼2014-05-08 08:58:21
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hsya720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 夏至1990 at 2014-05-08 08:58:21
我做原核时候，就是裂解液和超声破碎一起的，我觉得一起i较好，双管齐下吧，楼主好好考虑，破碎太剧烈，也不好。10min，超神5s,停10s吧。60%功率。真核的楼主试着摸索下

那请问你用的裂解液是哪一种？自己配的还是买的啊？
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6楼2014-05-09 10:37:51
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by hsya720 at 2014-05-09 10:37:51
那请问你用的裂解液是哪一种？自己配的还是买的啊？...

自己配的啊，真核就不清楚了
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
7楼2014-05-09 10:57:05
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
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瞎搞。真核细胞干嘛需要超声破碎？原核是有细胞壁。真核细胞随便搞搞不就破了。。。了不起用针头打两下切断基因组DNA免得太黏。
你完全可以去参考qiagen的产品说明～

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-05-09 11:12:08
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