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hsya720

新虫 (初入文坛)

[交流] His tag真核细胞蛋白纯化 已有8人参与

求各位大神,我想在真核细胞HEK293中过表达带His标签的重组蛋白,然后通过镍柱过柱子纯化蛋白,测酶活性。有没有知道该怎么破碎真核细胞提取蛋白啊,用超声破碎还是裂解液?裂解液的成分会不会对过柱子有影响啊?谢谢各位了。
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for5

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-03 20:05:10
都可以的。不过你确定不是表达在上清么?鉴定没?上清和细胞裂解液做下wb。如果在胞内的话,那才多少点蛋白,你要收多少细胞才能纯化?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
操蛋的XX
2楼2014-05-03 17:55:45
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
真核HEK293瞬时转染是常做的实验,其实纯化算是比原核简单的吧,破碎也可以超声也可以加细胞裂解液,不像包涵体比较复杂,而且真核表达 上清几率高而且活性有保障~
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
9楼2015-11-10 13:38:04
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zhang001zh

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
真核细胞破碎很容易的,可以直接用低渗溶液加去污剂快速破碎,稍微用超声辅助降低下溶液粘度就好了。
10楼2015-11-12 13:37:44
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普通回帖

hsya720

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-05-03 17:55:45
都可以的。不过你确定不是表达在上清么?鉴定没?上清和细胞裂解液做下wb。如果在胞内的话,那才多少点蛋白,你要收多少细胞才能纯化?

我确定是在细胞内表达的,确实是量比较小,我想先用10大皿左右的细胞试一次,我听说裂解液中的EDTA会影响柱子的吸附,所以想用超声破碎的方法,但是不知道超声破碎要用的时间,频率?
3楼2014-05-03 18:16:15
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heylixing

铁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
20-40%的功率,超声8s,停8s,超声总时间10min。我当时超声大肠用的。注意冰浴冷却。EDTA是会影响镍柱。尽量不要用。
4楼2014-05-04 22:02:30
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我做原核时候,就是裂解液和超声破碎一起的,我觉得一起i较好,双管齐下吧,楼主好好考虑,破碎太剧烈,也不好。10min,超神5s,停10s吧。60%功率。真核的楼主试着摸索下
Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
5楼2014-05-08 08:58:21
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hsya720

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 夏至1990 at 2014-05-08 08:58:21
我做原核时候,就是裂解液和超声破碎一起的,我觉得一起i较好,双管齐下吧,楼主好好考虑,破碎太剧烈,也不好。10min,超神5s,停10s吧。60%功率。真核的楼主试着摸索下

那请问你用的裂解液是哪一种?自己配的还是买的啊?
6楼2014-05-09 10:37:51
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by hsya720 at 2014-05-09 10:37:51
那请问你用的裂解液是哪一种?自己配的还是买的啊?...

自己配的啊,真核就不清楚了
Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
7楼2014-05-09 10:57:05
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
瞎搞。真核细胞干嘛需要超声破碎?原核是有细胞壁。真核细胞随便搞搞不就破了。。。了不起用针头打两下切断基因组DNA免得太黏。
你完全可以去参考qiagen的产品说明~

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-05-09 11:12:08
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