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ljj0720

银虫 (正式写手)

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[求助] 目的蛋白表达纯化，求教高手已有3人参与

最近在做蛋白纯化
一、证明目的蛋白有表达
1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的5mL液体 LB培养基中37℃，200rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL液体LB 中，37℃，200rpm，2.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出2 mL菌液为未诱导的电泳对照，取出2 mL菌液为诱导，加入诱导物IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,30度（前期摸索过条件，发现IPTG至终浓度为0.5 mmol/L最好），继续振荡培养4h。
4、诱导的菌液0.01%PBS悬浮，冰上超声破碎，超声10S，停10S,
5、超声上清、沉淀、未诱导各取30微升，加 7.5微升的5*蛋白上样缓冲液，煮沸7分钟，离心12000rpm, 2min, SDS-PAGE检测。
结果如下：图1

左1: 对照，左2: 超声沉淀，3: 超声上清，4: marker 红色位置是目的蛋白大小位置
从图中可以看出，虽然可溶性蛋白少，但是还是有的，所以想先尝试做可溶性蛋白表达。
二、大量表达的情况
配试剂
1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤）
50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑
1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑
1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑

诱导培养：取50微升保存的菌种，加入5微升AMP,加5ML的LB培养基，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的200ML液体LB 中，37℃，200rpm，2.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）后，培养液加入诱导物IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，30℃，200rpm条件下，继续振荡培养4小时。
破菌收集上清：离心（4℃，12000g，5min），弃上清，加4ML的1*NI-NTA（pH 8.0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，10s，10s，15min），离心（4℃，12000g，20min）收集上清。

过镍柱纯化：
1、将1ml 50% Ni-NTA His·Bind树脂悬液加入到4ml 1×Ni-NTA结合缓冲液中，轻柔混匀。待树脂自然沉降
后，用枪头吸去 4ml上清。
2、加入4ml制备好的裂解液，轻柔摇动棍匀，4℃结合60分钟。
3、将裂解液Ni-NTA His·Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中。
4、除去柱下端封闭盖子，离心，2000g,结合5min,离心4min,收集流出液（穿过峰），保存用于SDS-PAGE电泳分析。
5、以4ml 1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗2次，2000g,结合5min,离心4min,收集漂洗组分，用于SDS-PAGE电泳分析。
6、以0.5 ml 1×Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白4次。2000g,结合5min,离心4min,将洗脱组分分为四部分收集，并SDS-PAGE 电泳分
析各保存组分。
结果如图2
左1：marker, 左2：穿透液；左3：漂1；左4：漂2；左5：脱1.....
但是几乎没有洗脱下来，求教高手

图片1.png