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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组大肠杆菌 镍柱纯化
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

[求助] 重组大肠杆菌 镍柱纯化

各位虫子
我最近遇到了一个头疼的问题
我构建了一株重组大肠杆菌，载体是pET8a，宿主是BL21(3)
用TB培养基发酵24小时后离心收菌，超声波破碎离心后，通过镍柱纯化。
今天SDS-PAGE结果显示在破碎后样品和上样后洗脱样品中有蛋白条带，而且很多。而在不同浓度的咪唑洗下来的溶液中没有条带。胞外酶液有很多条带。
总而言之，重组大肠杆菌发酵后有部分分泌到胞外，有部分在胞内。在胞内的呢，挂不住镍柱，虫子们，这是为什么呢？
紧急求助啊
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我还年轻，我要上路！
1楼 2013-01-07 19:45:35
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
你应该把具体的纯化条件写出来，才好分析。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2013-01-07 20:59:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你指目的蛋白在wash buffer里还是直接在flow through里？
由于大量表达，造成部分菌体裂解而使目的蛋白在胞外也很正常。做SDS-PAGE上看到的条带确定是目的蛋白吗？是否做了空载体对照？
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3楼2013-01-08 08:53:40
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jk_xlzy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
~你的表达产物带有可结合到Ni2+上的氨基酸残基吗？
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4楼2013-01-09 11:27:54
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可可糖xz

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定你的质粒上是否带有组氨酸标签！另外也有可能有的酶挂不到柱子上的，因为蛋白折叠可能会把标签包在里面，这样就很难被挂住！
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5楼2013-01-09 12:17:12
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转基因猴子

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jk_xlzy at 2013-01-09 11:27:54
~你的表达产物带有可结合到Ni2+上的氨基酸残基吗？

his-taq
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我还年轻，我要上路！
6楼2013-01-10 08:59:44
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