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转基因猴子

木虫 (正式写手)

[求助] 重组大肠杆菌 镍柱纯化

各位虫子
我最近遇到了一个头疼的问题
我构建了一株重组大肠杆菌,载体是pET8a,宿主是BL21(3)
用TB培养基发酵24小时后离心收菌,超声波破碎离心后,通过镍柱纯化。
今天SDS-PAGE结果显示在破碎后样品和上样后洗脱样品中有蛋白条带,而且很多。而在不同浓度的咪唑洗下来的溶液中没有条带。胞外酶液有很多条带。
总而言之,重组大肠杆菌发酵后有部分分泌到胞外,有部分在胞内。在胞内的呢,挂不住镍柱,虫子们,这是为什么呢?
紧急求助啊
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我还年轻,我要上路!
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jk_xlzy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
~你的表达产物带有可结合到Ni2+上的氨基酸残基吗?
4楼2013-01-09 11:27:54
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查看全部 6 个回答

snoopyzxx

木虫 (著名写手)

你应该把具体的纯化条件写出来,才好分析。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
2楼2013-01-07 20:59:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你指目的蛋白在wash buffer里还是直接在flow through里?
由于大量表达,造成部分菌体裂解而使目的蛋白在胞外也很正常。做SDS-PAGE上看到的条带确定是目的蛋白吗?是否做了空载体对照?
3楼2013-01-08 08:53:40
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可可糖xz

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
确定你的质粒上是否带有组氨酸标签!另外也有可能有的酶挂不到柱子上的,因为蛋白折叠可能会把标签包在里面,这样就很难被挂住!
5楼2013-01-09 12:17:12
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