应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法
211/1返回列表
查看: 2430  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法

各位大侠：
本人最近用大肠杆菌表达烟草蚀斑病毒(TEV)酶，蛋白表达出来了，纯度浓度都很高，
但是TEV酶切效率很低。
我的制备过程如下：大肠杆菌培养基是TB 培养基，37摄氏度培养至对数期后降温至18度，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养20小时后收菌。超声破碎后纯化过程在冰水混合物中进行。
请问各位大侠用的什么培养基？以及用什么培养纯化条件。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-06 18:47:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

laoshu16

银虫 (小有名气)
wmqouc(金币+1): 2011-02-22 21:24:10
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-10 12:27:31:

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高

还不错 最近做了一次 在四度切完全了
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2011-01-17 15:51:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
自己顶一下
别沉了
回复此楼
2楼2011-01-07 09:06:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

laoshu16

银虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-07 21:35:13
wmqouc(金币+1): 2011-01-09 11:38:33
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-01-07 10:32:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-07 10:32:46:
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件

请问“打出气泡”意味着什么？
你用LB培养基，培养和诱导的条件是什么？
谢谢！
赞一下 回复此楼
4楼2011-01-09 11:40:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
wmqouc(金币+1): 2011-01-10 15:40:45
wmqouc(金币+2):谢谢！ 2011-01-12 10:34:56
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:20
SB培养基。0.1mM IPTG，20度20小时。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-11 at 10:06 ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-01-09 11:46:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiangping

金虫 (正式写手)
你查阅一些国外的文献之类的
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-09 11:50:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

laoshu16

银虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:07:59
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-07 10:32:46:
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-01-10 12:27:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-10 12:27:31:

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高

你的酶切效率怎样啊？
赞一下 回复此楼
8楼2011-01-10 15:45:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 一碗水端平 at 2011-01-09 11:46:44:
SB培养基。0.1mM IPTG，20度20小时。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-11 at 10:06 ]

多谢回复
请问在镍柱纯化后的TEV应该用脱盐柱脱去咪唑吧？
赞一下 回复此楼
9楼2011-01-12 10:37:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:12
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-12 10:37:42:

多谢回复
请问在镍柱纯化后的TEV应该用脱盐柱脱去咪唑吧？

也可以透析去咪唑。不过时间比较长。脱盐的话会快很多。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-01-13 09:22:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-13 14:56:14
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-10 15:45:57:

你的酶切效率怎样啊？

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。
赞一下 回复此楼
11楼2011-01-13 10:40:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 一碗水端平 at 2011-01-13 10:40:57:

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白酶活性。
我用购买的TEV切我的蛋白，发现当我的蛋白280nmOD吸收在0.8时，待切蛋白：购买TEV=3：1，才能酶切完全，就是说购买的TEV切我的蛋白效率不是很高。用自制的TEV切效率更低。
赞一下 回复此楼
12楼2011-01-13 15:09:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-14 20:03:25
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

PMSF不会抑制活性的，我在纯化时也加入PMSF的。你的蛋白可能是挺难切的，连买的都要3:1。我们实验室的蛋白有的是50-100:1；有的是10-20:1。
我第一次纯化时就把菌在-80度冰箱冻了2天，结果纯化出来就没什么活性。后来就收菌后直接纯化，活性就还可以。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-14 at 13:14 ]
赞一下 回复此楼
13楼2011-01-14 13:13:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

laoshu16

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

你说的是摩尔比吗 酶活这么高
赞一下 回复此楼
15楼2011-01-17 15:55:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-17 07:51:10:
还不错 最近做了一次 在四度切完全了

请把你的实验protocal发给我，学习一下吧，谢谢！
赞一下 回复此楼
16楼2011-02-23 09:38:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

laoshu16

银虫 (小有名气)

PROTOCAL

引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-17 15:55:14:
你说的是摩尔比吗 酶活这么高

这是我参考的protocal 除了PEI沉淀没有做 其它都是按照它做的
赞一下 回复此楼
17楼2011-02-24 09:15:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-02-24 09:15:08:
这是我参考的protocal 除了PEI沉淀没有做 其它都是按照它做的

请问一下，按照这个protocal进行TEV的纯化，条带浓度和纯度怎么样？纯化的TEV你酶切多长时间？还有你纯化得来的TEV有没有透析去咪唑？我最近也在做类似的实验，纯化效果还可以，就是TEV酶切的效果不好啊！
赞一下(1人) 回复此楼
18楼2011-05-11 10:30:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

198619

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
是啊！我最近也在作TEV切蛋白了，可是老是切不动，TEV纯化效果还不错。浓度也不错的。可就是切不动我的目的蛋白。请指教！谢谢！
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2011-12-16 10:02:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物-TJAB

新虫 (小有名气)
可通过超滤换液的
赞一下 回复此楼
20楼2012-07-04 17:59:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

binbin309

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
跪求TEV蛋白酶的表达质粒或者DNA序列
赞一下 回复此楼
21楼2018-08-28 21:10:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wmqouc 的主题更新
211/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 311求调剂 +5 26研0 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:21 by a不易
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +11 不知道叫什么！ 2026-03-15 13/650 2026-03-16 15:10 by 了了了了。。
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 求调剂！ +4 朔朔话 2026-03-09 4/200 2026-03-14 01:38 by JourneyLucky
[考研] 306求调剂 +4 唐薏薏 2026-03-09 4/200 2026-03-14 01:19 by JourneyLucky
[考研] 265求调剂 +9 小木虫085600 2026-03-09 12/600 2026-03-14 01:11 by JourneyLucky
[考研] 318求调剂 +3 李新光 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:21 by JourneyLucky
[考研] 341求调剂 +4 番茄头--- 2026-03-10 4/200 2026-03-13 23:12 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 Dizzy123@ 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:02 by JourneyLucky
[考研] 一志愿西南交大，材料专硕317求调剂 +5 lx8568 2026-03-11 5/250 2026-03-13 21:43 by peike
[考研] 工科，求调剂 +3 我887 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:39 by JourneyLucky
[考研] 315求调剂 +9 小羊小羊_ 2026-03-11 10/500 2026-03-13 21:13 by SXNU李老师
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 工科调剂 +4 Jiang191123！ 2026-03-11 4/200 2026-03-13 15:15 by Miko19
[考研] 大连大学化学专业研究生调剂 +3 琪久. 2026-03-10 8/400 2026-03-11 10:02 by 琪久.
[考研] 0703化学调剂 +3 三dd. 2026-03-10 3/150 2026-03-10 15:45 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭