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wmqouc

金虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法

各位大侠：
本人最近用大肠杆菌表达烟草蚀斑病毒(TEV)酶，蛋白表达出来了，纯度浓度都很高，
但是TEV酶切效率很低。
我的制备过程如下：大肠杆菌培养基是TB 培养基，37摄氏度培养至对数期后降温至18度，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养20小时后收菌。超声破碎后纯化过程在冰水混合物中进行。
请问各位大侠用的什么培养基？以及用什么培养纯化条件。

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1楼 2011-01-06 18:47:21

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一碗水端平

木虫 (职业作家)

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wmqouc(金币+1): 2011-01-14 20:03:25

引用回帖:

Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

PMSF不会抑制活性的，我在纯化时也加入PMSF的。你的蛋白可能是挺难切的，连买的都要3:1。我们实验室的蛋白有的是50-100:1；有的是10-20:1。
我第一次纯化时就把菌在-80度冰箱冻了2天，结果纯化出来就没什么活性。后来就收菌后直接纯化，活性就还可以。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-14 at 13:14 ]