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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法
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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法

各位大侠：
本人最近用大肠杆菌表达烟草蚀斑病毒(TEV)酶，蛋白表达出来了，纯度浓度都很高，
但是TEV酶切效率很低。
我的制备过程如下：大肠杆菌培养基是TB 培养基，37摄氏度培养至对数期后降温至18度，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养20小时后收菌。超声破碎后纯化过程在冰水混合物中进行。
请问各位大侠用的什么培养基？以及用什么培养纯化条件。
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1楼2011-01-06 18:47:21
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
wmqouc(金币+1): 2011-01-10 15:40:45
wmqouc(金币+2):谢谢！ 2011-01-12 10:34:56
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:20
SB培养基。0.1mM IPTG，20度20小时。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-11 at 10:06 ]
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5楼2011-01-09 11:46:44
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:12
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-12 10:37:42:

多谢回复
请问在镍柱纯化后的TEV应该用脱盐柱脱去咪唑吧？

也可以透析去咪唑。不过时间比较长。脱盐的话会快很多。
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10楼2011-01-13 09:22:29
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-13 14:56:14
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-10 15:45:57:

你的酶切效率怎样啊？

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。
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11楼2011-01-13 10:40:57
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-14 20:03:25
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

PMSF不会抑制活性的，我在纯化时也加入PMSF的。你的蛋白可能是挺难切的，连买的都要3:1。我们实验室的蛋白有的是50-100:1；有的是10-20:1。
我第一次纯化时就把菌在-80度冰箱冻了2天，结果纯化出来就没什么活性。后来就收菌后直接纯化，活性就还可以。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-14 at 13:14 ]
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13楼2011-01-14 13:13:34
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