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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法
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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法

各位大侠：
本人最近用大肠杆菌表达烟草蚀斑病毒(TEV)酶，蛋白表达出来了，纯度浓度都很高，
但是TEV酶切效率很低。
我的制备过程如下：大肠杆菌培养基是TB 培养基，37摄氏度培养至对数期后降温至18度，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养20小时后收菌。超声破碎后纯化过程在冰水混合物中进行。
请问各位大侠用的什么培养基？以及用什么培养纯化条件。
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1楼 2011-01-06 18:47:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

laoshu16

银虫 (小有名气)
wmqouc(金币+1): 2011-02-22 21:24:10
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-10 12:27:31:

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高

还不错 最近做了一次 在四度切完全了
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14楼2011-01-17 15:51:10
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普通回帖

wmqouc

金虫 (著名写手)
自己顶一下
别沉了
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2楼2011-01-07 09:06:07
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laoshu16

银虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-07 21:35:13
wmqouc(金币+1): 2011-01-09 11:38:33
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件
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3楼2011-01-07 10:32:46
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-07 10:32:46:
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件

请问“打出气泡”意味着什么？
你用LB培养基，培养和诱导的条件是什么？
谢谢！
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4楼2011-01-09 11:40:30
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
wmqouc(金币+1): 2011-01-10 15:40:45
wmqouc(金币+2):谢谢！ 2011-01-12 10:34:56
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:20
SB培养基。0.1mM IPTG，20度20小时。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-11 at 10:06 ]
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5楼2011-01-09 11:46:44
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xiangping

金虫 (正式写手)
你查阅一些国外的文献之类的
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6楼2011-01-09 11:50:35
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laoshu16

银虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:07:59
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-07 10:32:46:
我也在做TEV 我用的是LB培养基 活性不好是不是破碎细胞时间过长或者打出气泡了 或者你的酶切条件不是它的最佳条件

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高
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7楼2011-01-10 12:27:31
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-10 12:27:31:

1mM IPTG 30°C 诱导3-4h 收获 超声的时候最好不要发热和打出气泡 时间短一点 我现在还在摸纯化的条件 最后要么不够纯 要么浓度不高

你的酶切效率怎样啊？
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8楼2011-01-10 15:45:57
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 一碗水端平 at 2011-01-09 11:46:44:
SB培养基。0.1mM IPTG，20度20小时。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-11 at 10:06 ]

多谢回复
请问在镍柱纯化后的TEV应该用脱盐柱脱去咪唑吧？
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9楼2011-01-12 10:37:42
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:08:12
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-12 10:37:42:

多谢回复
请问在镍柱纯化后的TEV应该用脱盐柱脱去咪唑吧？

也可以透析去咪唑。不过时间比较长。脱盐的话会快很多。
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10楼2011-01-13 09:22:29
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-13 14:56:14
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-10 15:45:57:

你的酶切效率怎样啊？

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。
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11楼2011-01-13 10:40:57
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 一碗水端平 at 2011-01-13 10:40:57:

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白酶活性。
我用购买的TEV切我的蛋白，发现当我的蛋白280nmOD吸收在0.8时，待切蛋白：购买TEV=3：1，才能酶切完全，就是说购买的TEV切我的蛋白效率不是很高。用自制的TEV切效率更低。
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12楼2011-01-13 15:09:03
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一碗水端平

木虫 (职业作家)
wmqouc(金币+1): 2011-01-14 20:03:25
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

PMSF不会抑制活性的，我在纯化时也加入PMSF的。你的蛋白可能是挺难切的，连买的都要3:1。我们实验室的蛋白有的是50-100:1；有的是10-20:1。
我第一次纯化时就把菌在-80度冰箱冻了2天，结果纯化出来就没什么活性。后来就收菌后直接纯化，活性就还可以。

[ Last edited by 一碗水端平 on 2011-1-14 at 13:14 ]
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13楼2011-01-14 13:13:34
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laoshu16

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2011-01-13 15:09:03:

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白 ...

你说的是摩尔比吗 酶活这么高
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15楼2011-01-17 15:55:14
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-17 07:51:10:
还不错 最近做了一次 在四度切完全了

请把你的实验protocal发给我，学习一下吧，谢谢！
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16楼2011-02-23 09:38:48
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laoshu16

银虫 (小有名气)

PROTOCAL

引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-01-17 15:55:14:
你说的是摩尔比吗 酶活这么高

这是我参考的protocal 除了PEI沉淀没有做 其它都是按照它做的
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17楼2011-02-24 09:15:08
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101202139

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2011-02-24 09:15:08:
这是我参考的protocal 除了PEI沉淀没有做 其它都是按照它做的

请问一下，按照这个protocal进行TEV的纯化，条带浓度和纯度怎么样？纯化的TEV你酶切多长时间？还有你纯化得来的TEV有没有透析去咪唑？我最近也在做类似的实验，纯化效果还可以，就是TEV酶切的效果不好啊！
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18楼2011-05-11 10:30:45
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198619

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
是啊！我最近也在作TEV切蛋白了，可是老是切不动，TEV纯化效果还不错。浓度也不错的。可就是切不动我的目的蛋白。请指教！谢谢！
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19楼2011-12-16 10:02:55
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生物-TJAB

新虫 (小有名气)
可通过超滤换液的
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20楼2012-07-04 17:59:16
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binbin309

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
跪求TEV蛋白酶的表达质粒或者DNA序列
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21楼2018-08-28 21:10:48
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