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金虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】求助制备有活性烟草蚀斑病毒(TEV)酶的方法

各位大侠：
本人最近用大肠杆菌表达烟草蚀斑病毒(TEV)酶，蛋白表达出来了，纯度浓度都很高，
但是TEV酶切效率很低。
我的制备过程如下：大肠杆菌培养基是TB 培养基，37摄氏度培养至对数期后降温至18度，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养20小时后收菌。超声破碎后纯化过程在冰水混合物中进行。
请问各位大侠用的什么培养基？以及用什么培养纯化条件。

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1楼2011-01-06 18:47:21

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引用回帖:

Originally posted by 一碗水端平 at 2011-01-13 10:40:57:

看切什么蛋白。一般是1:50 酶切1个小时。

纯化是最好不要将菌放到冰箱里冻，而是收了菌后直接纯化，这样活性会好一些。

谢谢回复！
我一般是将菌液收后先在液氮冻住，然后冻于-80度冰箱，第二天或过几天再纯化蛋白。
看来今后我应该收菌后接着做。
还有我上次纯化TEV时，在超声破碎时加入了PMSF，下次做就不加PMSF了，怕抑制蛋白酶活性。
我用购买的TEV切我的蛋白，发现当我的蛋白280nmOD吸收在0.8时，待切蛋白：购买TEV=3：1，才能酶切完全，就是说购买的TEV切我的蛋白效率不是很高。用自制的TEV切效率更低。