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GST纯化问题求助已有3人参与
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初次做GST纯化，希望得到各位大虾的指点：） 1、Rosetta表达的pGEX重组质粒，16度过夜诱导； 2、超声破碎细胞，超声功率不到400w，8min（超1s，停2s）； 3、使用1 ml GSTrap FF 预装柱（新柱子但过期半年），严格按照说明书操作：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml binding buffer洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱； 4、结果如图1：line1为超声破碎上清、line2为loading穿刺液、line3、4为elution洗脱液（最浓的条带即为目的蛋白）。从结果可以看出，挂柱效果不好，并且杂蛋白也非特异性结合，so改进了纯化方案中的洗柱子buffer； 5、改进方案：：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml wash buffer（添加1%曲拉通，500mM NaCl）洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱； 6、改进后结果如图2：line1为细胞破碎上清、line2为穿刺样品、line3为wash样品、line4为纯化样品，未见好转。 可能原因： 1、柱子过期？ 2、蛋白超声破碎条件过于剧烈？ 还望各位高手帮忙分析其他可能的原因，带金币谢过！  2.jpg  1.jpg |
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