应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢
71/1返回列表
查看: 4244  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

consist10

金虫 (正式写手)

[求助] 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢

用pGEX-4T-1载体表达HPV18 L1蛋白，为可溶性表达。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在，在进行GST纯化前，先后加入ATP, MgCl2，KCL，20%甘油和3.5M尿素去除伴侣，13000rpm，4度离心。将菌体上清直接进行GST纯化，用含有3mM DTT，0.2M Nacl，1mM EDTA的50 mM Tris pH 8.0溶液洗去杂蛋白后， 用含有75mM还原型谷胱甘肽，0.1M Nacl的50mM Tirs（pH9.0）洗脱HPV18 L1-GST融合蛋白。看文献中有在凝血酶中加入0.1-0.2M Nacl和2.5mM 氯化钙增加酶活性的，于是将洗脱产物用含有这两种成分的20 mM Tris pH 8.4溶液进行4度透析，在透析6-10小时左右发现有融合蛋白沉淀析出，请教大家我的实验操作存在什么问题。该如何进行凝血酶酶切切去GST标签，酶切体系是什么？酶切时要注意什么问题？如何保存GST纯化的融合蛋白产物？
    另外，我也尝试了将菌体上清液挂在GST树脂上，用50 mM Tris pH 8.0 洗去杂蛋白，然后加入3.5mL 凝血酶（用25mM Tris pH8.0溶解，浓度为20 U/mL）。在凝血酶完全进入GST树脂后，4度静止作用20小时，接着用Tris洗脱柱子，洗出来的是凝血酶。最后用还原型谷胱甘肽洗脱柱子，洗出来的是HPV18 L1-GST融合蛋白，也含有少量凝血酶。凝血酶柱上酶切的失败原因是什么。文献中有用25mM Tris pH9.0溶解凝血酶，然后进行酶切的，这样可行吗？另外， GST纯化时，均是4度循环上样3小时，但挂柱效率仍然不高，如何提高挂柱效率呢？由于急于毕业，实验遇到这个难题，十分着急。希望大家给予指教，十分谢谢！
PS：混数要金币的请绕行！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-01 09:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
consist10: 金币+2 2013-03-02 20:24:34
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 14:21:49
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。
赞一下 回复此楼
静心做事。
2楼2013-03-01 16:52:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

consist10

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiangyhai at 2013-03-01 16:52:02
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。

不会的  因为之前有人用pGEX-4T-1表达这个这个蛋白的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-01 16:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoucd07net

铜虫 (小有名气)
放在一起，时间长点，效果挺好
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-03-25 18:02:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xskht492
5楼2017-08-20 13:56:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

微风燕子斜

新虫 (初入文坛)
请问您问题解决了吗 我现在也是凝血酶酶切不下来，着急。谢谢。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
6楼2019-11-26 23:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dbl0301

银虫 (初入文坛)
凝血酶可以在4°有效酶切吗？
赞一下 回复此楼
7楼2021-07-15 22:34:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 consist10 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +7 羊腰板 2026-08-21 7/350 2026-08-21 21:28 by iwuli
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 12/600 2026-08-21 19:46 by kulium
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 14/700 2026-08-21 16:51 by applepetty
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 人气不行了 +7 fansofjerry 2026-08-21 7/350 2026-08-21 14:13 by Vivilian
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +23 yaoyewhu2008 2026-08-20 25/1250 2026-08-21 12:19 by Poppy1104
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +15 kkkl_v 2026-08-19 16/800 2026-08-21 11:22 by 365372687
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭