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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢
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consist10

金虫 (正式写手)

[求助] 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢

用pGEX-4T-1载体表达HPV18 L1蛋白，为可溶性表达。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在，在进行GST纯化前，先后加入ATP, MgCl2，KCL，20%甘油和3.5M尿素去除伴侣，13000rpm，4度离心。将菌体上清直接进行GST纯化，用含有3mM DTT，0.2M Nacl，1mM EDTA的50 mM Tris pH 8.0溶液洗去杂蛋白后， 用含有75mM还原型谷胱甘肽，0.1M Nacl的50mM Tirs（pH9.0）洗脱HPV18 L1-GST融合蛋白。看文献中有在凝血酶中加入0.1-0.2M Nacl和2.5mM 氯化钙增加酶活性的，于是将洗脱产物用含有这两种成分的20 mM Tris pH 8.4溶液进行4度透析，在透析6-10小时左右发现有融合蛋白沉淀析出，请教大家我的实验操作存在什么问题。该如何进行凝血酶酶切切去GST标签，酶切体系是什么？酶切时要注意什么问题？如何保存GST纯化的融合蛋白产物？
    另外，我也尝试了将菌体上清液挂在GST树脂上，用50 mM Tris pH 8.0 洗去杂蛋白，然后加入3.5mL 凝血酶（用25mM Tris pH8.0溶解，浓度为20 U/mL）。在凝血酶完全进入GST树脂后，4度静止作用20小时，接着用Tris洗脱柱子，洗出来的是凝血酶。最后用还原型谷胱甘肽洗脱柱子，洗出来的是HPV18 L1-GST融合蛋白，也含有少量凝血酶。凝血酶柱上酶切的失败原因是什么。文献中有用25mM Tris pH9.0溶解凝血酶，然后进行酶切的，这样可行吗？另外， GST纯化时，均是4度循环上样3小时，但挂柱效率仍然不高，如何提高挂柱效率呢？由于急于毕业，实验遇到这个难题，十分着急。希望大家给予指教，十分谢谢！
PS：混数要金币的请绕行！
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1楼 2013-03-01 09:53:17
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
consist10: 金币+2 2013-03-02 20:24:34
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 14:21:49
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。
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静心做事。
2楼2013-03-01 16:52:02
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consist10

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiangyhai at 2013-03-01 16:52:02
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。

不会的  因为之前有人用pGEX-4T-1表达这个这个蛋白的。
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3楼2013-03-01 16:55:48
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zhoucd07net

铜虫 (小有名气)
放在一起，时间长点，效果挺好
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4楼2013-03-25 18:02:12
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xskht492
5楼2017-08-20 13:56:17
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微风燕子斜

新虫 (初入文坛)
请问您问题解决了吗 我现在也是凝血酶酶切不下来，着急。谢谢。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2019-11-26 23:20:21
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dbl0301

银虫 (初入文坛)
凝血酶可以在4°有效酶切吗？
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7楼2021-07-15 22:34:23
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