| 查看: 3736 | 回复: 6 | ||
consist10金虫 (正式写手)
|
[求助]
求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢
|
|
用pGEX-4T-1载体表达HPV18 L1蛋白，为可溶性表达。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在，在进行GST纯化前，先后加入ATP, MgCl2，KCL，20%甘油和3.5M尿素去除伴侣，13000rpm，4度离心。将菌体上清直接进行GST纯化，用含有3mM DTT，0.2M Nacl，1mM EDTA的50 mM Tris pH 8.0溶液洗去杂蛋白后， 用含有75mM还原型谷胱甘肽，0.1M Nacl的50mM Tirs（pH9.0）洗脱HPV18 L1-GST融合蛋白。看文献中有在凝血酶中加入0.1-0.2M Nacl和2.5mM 氯化钙增加酶活性的，于是将洗脱产物用含有这两种成分的20 mM Tris pH 8.4溶液进行4度透析，在透析6-10小时左右发现有融合蛋白沉淀析出，请教大家我的实验操作存在什么问题。该如何进行凝血酶酶切切去GST标签，酶切体系是什么？酶切时要注意什么问题？如何保存GST纯化的融合蛋白产物？ 另外，我也尝试了将菌体上清液挂在GST树脂上，用50 mM Tris pH 8.0 洗去杂蛋白，然后加入3.5mL 凝血酶（用25mM Tris pH8.0溶解，浓度为20 U/mL）。在凝血酶完全进入GST树脂后，4度静止作用20小时，接着用Tris洗脱柱子，洗出来的是凝血酶。最后用还原型谷胱甘肽洗脱柱子，洗出来的是HPV18 L1-GST融合蛋白，也含有少量凝血酶。凝血酶柱上酶切的失败原因是什么。文献中有用25mM Tris pH9.0溶解凝血酶，然后进行酶切的，这样可行吗？另外， GST纯化时，均是4度循环上样3小时，但挂柱效率仍然不高，如何提高挂柱效率呢？由于急于毕业，实验遇到这个难题，十分着急。希望大家给予指教，十分谢谢！ PS：混数要金币的请绕行！ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有128人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复- 蛋白互作必会，GST纯化遇到的问题
已经有13人回复
- 蛋白降解的问题
已经有11人回复
- GST融合蛋白纯化求助 ！！！
已经有19人回复
- 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
已经有14人回复
- 【求助/交流】凝血酶切割GST-tag 求助！
已经有13人回复
- 【求助/交流】谁知道如何去除GST标签啊，帮帮忙啊，急！
已经有4人回复
jiangyhai
金虫 (著名写手)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 4641.5
- 散金: 946
- 红花: 4
- 帖子: 1405
- 在线: 641.6小时
- 虫号: 306986
- 注册: 2006-12-16
- 性别: GG
- 专业: 数论
2楼2013-03-01 16:52:02
consist10
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 736.2
- 散金: 86
- 帖子: 728
- 在线: 186.6小时
- 虫号: 634640
- 注册: 2008-10-23
- 专业: 黏膜免疫疾病
3楼2013-03-01 16:55:48
zhoucd07net
铜虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 18.8
- 红花: 1
- 帖子: 160
- 在线: 48.4小时
- 虫号: 1681227
- 注册: 2012-03-10
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2013-03-25 18:02:12
 |
5楼2017-08-20 13:56:17
6楼2019-11-26 23:20:21
dbl0301
银虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 306
- 帖子: 49
- 在线: 48.3小时
- 虫号: 1957544
- 注册: 2012-08-26
- 性别: GG
- 专业: 免疫学研究新技术与新方法
7楼2021-07-15 22:34:23