应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
71/1返回列表
查看: 3914  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

consist10

金虫 (正式写手)

[求助] 求助GST纯化，凝血酶酶切！谢谢

用pGEX-4T-1载体表达HPV18 L1蛋白，为可溶性表达。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在，在进行GST纯化前，先后加入ATP, MgCl2，KCL，20%甘油和3.5M尿素去除伴侣，13000rpm，4度离心。将菌体上清直接进行GST纯化，用含有3mM DTT，0.2M Nacl，1mM EDTA的50 mM Tris pH 8.0溶液洗去杂蛋白后， 用含有75mM还原型谷胱甘肽，0.1M Nacl的50mM Tirs（pH9.0）洗脱HPV18 L1-GST融合蛋白。看文献中有在凝血酶中加入0.1-0.2M Nacl和2.5mM 氯化钙增加酶活性的，于是将洗脱产物用含有这两种成分的20 mM Tris pH 8.4溶液进行4度透析，在透析6-10小时左右发现有融合蛋白沉淀析出，请教大家我的实验操作存在什么问题。该如何进行凝血酶酶切切去GST标签，酶切体系是什么？酶切时要注意什么问题？如何保存GST纯化的融合蛋白产物？
    另外，我也尝试了将菌体上清液挂在GST树脂上，用50 mM Tris pH 8.0 洗去杂蛋白，然后加入3.5mL 凝血酶（用25mM Tris pH8.0溶解，浓度为20 U/mL）。在凝血酶完全进入GST树脂后，4度静止作用20小时，接着用Tris洗脱柱子，洗出来的是凝血酶。最后用还原型谷胱甘肽洗脱柱子，洗出来的是HPV18 L1-GST融合蛋白，也含有少量凝血酶。凝血酶柱上酶切的失败原因是什么。文献中有用25mM Tris pH9.0溶解凝血酶，然后进行酶切的，这样可行吗？另外， GST纯化时，均是4度循环上样3小时，但挂柱效率仍然不高，如何提高挂柱效率呢？由于急于毕业，实验遇到这个难题，十分着急。希望大家给予指教，十分谢谢！
PS：混数要金币的请绕行！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-01 09:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
consist10: 金币+2 2013-03-02 20:24:34
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 14:21:49
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。
赞一下 回复此楼
静心做事。
2楼2013-03-01 16:52:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

consist10

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiangyhai at 2013-03-01 16:52:02
看来是GST融合对你这个蛋白来说不合适。表达的蛋白可能是结构错误的。

不会的  因为之前有人用pGEX-4T-1表达这个这个蛋白的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-01 16:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoucd07net

铜虫 (小有名气)
放在一起，时间长点，效果挺好
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-03-25 18:02:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xskht492
5楼2017-08-20 13:56:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

微风燕子斜

新虫 (初入文坛)
请问您问题解决了吗 我现在也是凝血酶酶切不下来，着急。谢谢。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
6楼2019-11-26 23:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dbl0301

银虫 (初入文坛)
凝血酶可以在4°有效酶切吗？
赞一下 回复此楼
7楼2021-07-15 22:34:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 consist10 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 282求调剂 +3 呼吸都是减肥 2026-03-31 3/150 2026-03-31 10:00 by wangjy2002
[考研] 化学工程085602 305分求调剂 +26 RichLi_ 2026-03-25 26/1300 2026-03-31 09:42 by JourneyLucky
[考研] 0710生物学求调剂！ +3 叙述文 2026-03-31 3/150 2026-03-31 09:35 by longlotian
[考研] 理学07化学 303求调剂 +4 睿08 2026-03-27 4/200 2026-03-30 23:29 by yujianx
[有机交流] 考研调剂 +8 watb 2026-03-26 8/400 2026-03-30 18:40 by 544594351
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +5 兔兔兔111223314 2026-03-29 7/350 2026-03-30 18:29 by 兔兔兔111223314
[考研] 293求调剂 +3 末未mm 2026-03-30 5/250 2026-03-30 17:23 by 王保杰33
[考研] 318一志愿吉林大学生物与医药 求调剂 +5 笃行致远. 2026-03-28 5/250 2026-03-30 06:56 by ilovexiaobin
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +8 柳溪边 2026-03-26 8/400 2026-03-29 20:42 by 唐沐儿
[考研] 330分求调剂 +5 qzenlc 2026-03-29 5/250 2026-03-29 07:37 by 无际的草原
[考研] 312，生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
[考研] 352分 化工与材料 +5 海纳百川Ly 2026-03-27 5/250 2026-03-28 03:39 by fmesaito
[考研] 求调剂 +4 零八# 2026-03-27 4/200 2026-03-27 18:07 by yu221
[考研] 化学调剂 +4 爱吃番茄的旭 2026-03-24 5/250 2026-03-27 17:50 by kiokin
[考研] 考研调剂 +9 小蜡新笔 2026-03-26 9/450 2026-03-27 11:10 by 不吃魚的貓
[硕博家园] 北京林业大学硕导招生广告 +6 kongweilin 2026-03-26 8/400 2026-03-27 10:18 by FF_16
[考研] 调剂求收留 +7 果然有我 2026-03-26 7/350 2026-03-27 00:26 by wxiongid
[考研] 085602化学工程求调剂。 +4 平乐乐乐 2026-03-26 4/200 2026-03-26 17:57 by fmesaito
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 277分求调剂，跨调材料 +3 考研调剂lxh 2026-03-24 3/150 2026-03-24 13:52 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭