应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » GST纯化问题求助
51/1返回列表
查看: 1520  |  回复: 11
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小郭tongxue

铁虫 (小有名气)

[求助] GST纯化问题求助已有3人参与

初次做GST纯化，希望得到各位大虾的指点：）

1、Rosetta表达的pGEX重组质粒，16度过夜诱导；
2、超声破碎细胞，超声功率不到400w，8min（超1s，停2s）；
3、使用1 ml GSTrap FF 预装柱（新柱子但过期半年），严格按照说明书操作：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml binding buffer洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱；
4、结果如图1：line1为超声破碎上清、line2为loading穿刺液、line3、4为elution洗脱液（最浓的条带即为目的蛋白）。从结果可以看出，挂柱效果不好，并且杂蛋白也非特异性结合，so改进了纯化方案中的洗柱子buffer；
5、改进方案：：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml wash buffer（添加1%曲拉通，500mM NaCl）洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱；
6、改进后结果如图2：line1为细胞破碎上清、line2为穿刺样品、line3为wash样品、line4为纯化样品，未见好转。

可能原因：
1、柱子过期？
2、蛋白超声破碎条件过于剧烈？

还望各位高手帮忙分析其他可能的原因，带金币谢过！
GST纯化问题求助
2.jpg


GST纯化问题求助-1
1.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-11-29 20:56:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

莓林塔

木虫 (小有名气)
有没有试试改变下洗涤的pH啥的呢？小柱子同时摸呀，让美女师妹们一人摸俩条件^_^

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-30 17:13:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

莓林塔

木虫 (小有名气)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2013-12-01 08:54:35
我随便说一句，400w不算剧烈了吧？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
2楼2013-11-30 16:22:23
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-12-01 08:54:51
可先做批量纯化，摸好条件后再过柱。洗涤剂不可太多。
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-01 06:26:08
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

莓林塔

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要不要流速再慢点？
赞一下 回复此楼
6楼2013-12-02 14:51:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭