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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » GST纯化问题求助
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小郭tongxue

铁虫 (小有名气)

[求助] GST纯化问题求助已有3人参与

初次做GST纯化，希望得到各位大虾的指点：）

1、Rosetta表达的pGEX重组质粒，16度过夜诱导；
2、超声破碎细胞，超声功率不到400w，8min（超1s，停2s）；
3、使用1 ml GSTrap FF 预装柱（新柱子但过期半年），严格按照说明书操作：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml binding buffer洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱；
4、结果如图1：line1为超声破碎上清、line2为loading穿刺液、line3、4为elution洗脱液（最浓的条带即为目的蛋白）。从结果可以看出，挂柱效果不好，并且杂蛋白也非特异性结合，so改进了纯化方案中的洗柱子buffer；
5、改进方案：：5 ml binding buffer（1ml/min）, 1 ml sample (0.2-1 ml/min), 20 ml wash buffer（添加1%曲拉通，500mM NaCl）洗柱子直至无蛋白，5 ml elution buffer洗脱；
6、改进后结果如图2：line1为细胞破碎上清、line2为穿刺样品、line3为wash样品、line4为纯化样品，未见好转。

可能原因：
1、柱子过期？
2、蛋白超声破碎条件过于剧烈？

还望各位高手帮忙分析其他可能的原因，带金币谢过！
GST纯化问题求助
2.jpg


GST纯化问题求助-1
1.jpg
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1楼2013-11-29 20:56:06
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莓林塔

木虫 (小有名气)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2013-12-01 08:54:35
我随便说一句，400w不算剧烈了吧？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-11-30 16:22:23
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莓林塔

木虫 (小有名气)
有没有试试改变下洗涤的pH啥的呢？小柱子同时摸呀，让美女师妹们一人摸俩条件^_^

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-11-30 17:13:59
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-12-01 08:54:51
可先做批量纯化，摸好条件后再过柱。洗涤剂不可太多。
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4楼2013-12-01 06:26:08
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pixiaoluo

新虫 (初入文坛)
奉命顶贴
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5楼2013-12-02 09:19:18
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莓林塔

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要不要流速再慢点？
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6楼2013-12-02 14:51:59
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莓林塔

木虫 (小有名气)
咋样啦
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7楼2013-12-05 08:09:43
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小郭tongxue

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-12-05 08:09:43
咋样啦

停滞不前，在做另一个实验，它就休息了
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8楼2013-12-05 10:21:08
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

今天我也遇到了同样的问题，我的也是洗脱液中杂蛋白比较多。我用的是10mM GSH来洗脱的，专家建议在这之前先用低浓度的GSH来洗脱杂蛋白，感觉还蛮有道理的，可以一试。我明天再尝试一下，楼主不妨也试一试。
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9楼2014-02-13 19:54:53
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我门当时做的时候是增加氯化钠的浓度，并加入1%Trixon-100进行洗涤，效果还是不错的，杂蛋白消失不少
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多情总被无情扰。。。愁
10楼2014-02-14 09:21:20
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