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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AKTA蛋白纯化 考染检测无蛋白
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

[求助] AKTA蛋白纯化 考染检测无蛋白

事情发展如下：
1.本人重组质粒在Rosetta中诱导表达后，得到上清沉淀都有一定量的蛋白表达。于是扩大到500ml诱导，跑胶考染检测有蛋白。
2.AKTA当天纯化，在咪唑缓冲液100mM,250mM都有峰，师兄说应该是蛋白。
3.但当时实验室没有透析袋，纯化的蛋白没有立即透析，第二天才用透析袋透析了一天一夜，透析前的蛋白也没有出现沉淀，也没什么异味，用紫外检测浓度纯度也没有降低。透析后就跑胶考染，但没有出现任何条带（胶没有问题，有阳性对照）。透析后又检测了浓度，仍然没变低。
4.照理说就算因为没有立即透析，蛋白降解，也不应该一点条带都看不见吧，恳请各位师兄师姐前辈指教。万分感谢~
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1楼 2013-05-10 16:56:23
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-05-10 18:47:24
xiaoyu0127: 金币+3, ★有帮助, 担心是浓度低的问题，再用抗体做一下western 2013-05-13 15:46:17
做学术的，不像做蛋白技术表达的。你的量毕竟很小！我感觉你可能是洗脱下来时，蛋白浓度很低！建议你跑SDS-PAGE时，蛋白上样量增大一点！可以这样：
你把你的蛋白点个梯度，旁边点个BSA作对照！还可以通过BSA比对的方法估计蛋白浓度！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
2楼2013-05-10 18:34:58
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 鼓励 2013-05-10 23:56:12
xiaoyu0127: 金币+1, 请问biorad染色与考染有什么区别吗 2013-05-13 15:47:59
加biorad那种染料，有蛋白可以检测到，变色。
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修身、齐家、治国、平天下
3楼2013-05-10 23:35:55
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoyu0127: 金币+1, 谢谢 2013-05-13 15:47:09
如果你那个降解比较严重，成小碎片了，普通的蛋白胶就会出现看不到的情况，因为分子量小，已经跑出去了！
你可以试试在纯化过程中加一些蛋白酶抑制剂之类，buffer中适当加一些EDTA之类的！
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4楼2013-05-12 19:55:23
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoyu0127: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，我未纯化，纯化后，透析后都留样了，但无条带 2013-05-13 15:46:59
根据你的描述, 透析前后紫外检测的度数不变而最后样品跑胶却没有条带, 我觉得你的样品在透析前就几乎不含有你要的蛋白. 就像楼上说的, 下次实验是几个关键的步骤都留一点样, 跑胶时一并带上便于分析问题出在哪里.
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5楼2013-05-13 00:26:47
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