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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白纯化一个很挠头的问题，请高手指教！
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jia1012428

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化一个很挠头的问题，请高手指教！

1.用离子交换柱做纯化，上样后洗脱未被柱子结合的蛋白，总能洗下来一个尖峰，而在拉Nacl溶液梯度的时候，也能洗脱下的几个峰，但这些峰都没有酶活。
2.后来增大了上样量，还是这种情况，只不过每个峰都高和宽一些，更重要的是，在洗脱未被结合的蛋白的峰那里测到了酶活。
请问我的这种情况是不是书上说的柱子只结合杂蛋白，而不结合目的蛋白？
另外，1中测不到目的峰的酶活是不是因为蛋白太稀了，酶活检测不到；2中洗脱未结合的目的峰有发酵液色素的颜色，是不是上样量太大了，都没吸附到柱子上啊，所以才有酶活？
请高手指点！
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1楼2011-05-14 18:30:41
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

。。。。。。。。。。。
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2楼2011-05-15 00:09:51
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

jia1012428(金币+2): 专业，不用再说明！ 2011-05-15 23:11:13
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:40:04
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-15 00:09:51:
。。。。。。。。。。。

你想要的蛋白质等电点可能是多少，上样缓冲液的pH值是多少？如果是阳离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值高；如果是阴离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值低。而且要有一个pH值的差别才好吸附。

无论是阴还是阳，吸附的时候都要保持低盐，如果蛋白质等电点和上样缓冲液的pH值相差不大，那么一点儿盐就能解吸附，你要的蛋白质就只会在穿透液中。

下面传一张图片，AKTA的，你可以看A280曲线，穿透液里有很多蛋白质。
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3楼2011-05-15 00:11:18
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jia1012428

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-15 00:11:18:
你想要的蛋白质等电点可能是多少，上样缓冲液的pH值是多少？如果是阳离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值高；如果是阴离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值低。而且要有一个pH值的差别才好 ...

哥们，咱俩的图差不多啊，我用的阴离子交换柱。这也算纯化蛋白了把，但是我感觉第二次上样量太大了，洗脱未结合的蛋白时下来的液体有色素的颜色，是不是需要减少上样量啊。
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4楼2011-05-15 22:52:41
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jia1012428

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-15 00:11:18:
你想要的蛋白质等电点可能是多少，上样缓冲液的pH值是多少？如果是阳离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值高；如果是阴离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值低。而且要有一个pH值的差别才好 ...

你这个洗下来的蛋白浓度挺高啊，你用的是多大柱体积的柱子，我的柱体积是20mL！
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5楼2011-05-15 22:58:00
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶

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★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5): 鼓励交流 2011-05-16 08:40:18
1、你用了阴离子柱，确实是在纯化蛋白质，毫无置疑。
2、我的柱床体积也是20毫升，但这跟穿透液有没有酶活力没有关系。
3、你第一次上样时候穿透液的蛋白质峰达到550mau，第二次达到1400mau，是第一次的两倍多；第一次三次不连续梯度洗脱中最高峰为350mau，第二次为500mau。确实是上样量加大了。
4、总有些色素是不会被层析柱吸附的，也总有一些是被吸附的，这与色素的性质有关，与层析柱的吸附能力无关。
5、细碎线为电导率，最终的电导率约为85%，是不是用1M的氯化钠？两次穿透液中都有5-7%的电导率，说明你除盐除得不够干净，又或者你用来除盐的溶液本身的电导率就较大，所以很多蛋白质都不被吸附，建议你除盐干净一些，这样的要的蛋白质可能就能吸附了。
6、如果还不能吸附，那么可能是你的蛋白质等电点与起始缓冲液的pH值差不多，就要改变起始缓冲液的pH值。
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6楼2011-05-16 00:09:24
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jia1012428

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-16 00:09:24:
1、你用了阴离子柱，确实是在纯化蛋白质，毫无置疑。
2、我的柱床体积也是20毫升，但这跟穿透液有没有酶活力没有关系。
3、你第一次上样时候穿透液的蛋白质峰达到550mau，第二次达到1400mau，是第一次的两倍多； ...

我是直接将发酵液浓缩后透析的，没有用硫胺沉淀，所以盐离子浓度的问题不一定是主要问题。我跑个SDS-PAGE看看蛋白条带怎么样吧，如果很纯的话，就这样弄好了，很方便，不一定非要目的蛋白挂到柱子上，你说呢？
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7楼2011-05-16 08:32:34
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
是的，目标蛋白质流穿也是有好处的，去试试吧。不过如果还是不纯的话，就推荐除盐干净一些，我是不喜欢色素的，为了除色素我也曾经死过不少脑细胞了。
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8楼2011-05-16 16:27:10
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