| 查看: 1916 | 回复: 7 | |||||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
jia1012428铜虫 (小有名气)
|
[求助]
蛋白纯化一个很挠头的问题，请高手指教！
|
||||
|
1.用离子交换柱做纯化，上样后洗脱未被柱子结合的蛋白，总能洗下来一个尖峰，而在拉Nacl溶液梯度的时候，也能洗脱下的几个峰，但这些峰都没有酶活。 2.后来增大了上样量，还是这种情况，只不过每个峰都高和宽一些，更重要的是，在洗脱未被结合的蛋白的峰那里测到了酶活。 请问我的这种情况是不是书上说的柱子只结合杂蛋白，而不结合目的蛋白？ 另外，1中测不到目的峰的酶活是不是因为蛋白太稀了，酶活检测不到；2中洗脱未结合的目的峰有发酵液色素的颜色，是不是上样量太大了，都没吸附到柱子上啊，所以才有酶活？ 请高手指点！ |
回复此楼» 猜你喜欢
有多少人是今天查系统知道结果的？
已经有19人回复
-
国社科又开始会评了，不知道这次命运如何
已经有9人回复
-
能否申诉？
已经有5人回复
-
为什么到现在没收到通知？
已经有5人回复
-
有没有仍没收到信息的
已经有8人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 蛋白纯化遇到问题
已经有22人回复
- AMPK蛋白纯化问题讨论
已经有21人回复
- 关于液相的一个奇怪问题，请各位高手指教~~~~
已经有30人回复
- 蛋白纯化分离问题
已经有19人回复
- 关于蛋白纯化的问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】蛋白质纯化的疑难问题
已经有11人回复
- 请教一个缩小图像后的还原问题，希望有高手前辈能指教一下小弟
已经有6人回复
- 有关青基的一个弱弱的问题，请高手指教！
已经有12人回复
- 【求助/交流】蛋白纯化中透析的问题！！
已经有9人回复
- 【求助/交流】请教一个his-tag蛋白质纯化问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】镍柱纯化的蛋白保存在-20度一个星期，拿出来都是沉淀？？
已经有19人回复
- 【求助/交流】蛋白纯化后透析及浓缩问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19835
- 散金: 1704
- 红花: 121
- 帖子: 6621
- 在线: 2794小时
- 虫号: 856414
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5): 鼓励交流 2011-05-16 08:40:18
silicare(金币+5): 鼓励交流 2011-05-16 08:40:18
|
1、你用了阴离子柱，确实是在纯化蛋白质，毫无置疑。 2、我的柱床体积也是20毫升，但这跟穿透液有没有酶活力没有关系。 3、你第一次上样时候穿透液的蛋白质峰达到550mau，第二次达到1400mau，是第一次的两倍多；第一次三次不连续梯度洗脱中最高峰为350mau，第二次为500mau。确实是上样量加大了。 4、总有些色素是不会被层析柱吸附的，也总有一些是被吸附的，这与色素的性质有关，与层析柱的吸附能力无关。 5、细碎线为电导率，最终的电导率约为85%，是不是用1M的氯化钠？两次穿透液中都有5-7%的电导率，说明你除盐除得不够干净，又或者你用来除盐的溶液本身的电导率就较大，所以很多蛋白质都不被吸附，建议你除盐干净一些，这样的要的蛋白质可能就能吸附了。 6、如果还不能吸附，那么可能是你的蛋白质等电点与起始缓冲液的pH值差不多，就要改变起始缓冲液的pH值。 |
6楼2011-05-16 00:09:24
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19835
- 散金: 1704
- 红花: 121
- 帖子: 6621
- 在线: 2794小时
- 虫号: 856414
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
2楼2011-05-15 00:09:51
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19835
- 散金: 1704
- 红花: 121
- 帖子: 6621
- 在线: 2794小时
- 虫号: 856414
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
jia1012428(金币+2): 专业，不用再说明！ 2011-05-15 23:11:13
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:40:04
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:40:04
|
你想要的蛋白质等电点可能是多少，上样缓冲液的pH值是多少？如果是阳离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值高；如果是阴离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值低。而且要有一个pH值的差别才好吸附。 无论是阴还是阳，吸附的时候都要保持低盐，如果蛋白质等电点和上样缓冲液的pH值相差不大，那么一点儿盐就能解吸附，你要的蛋白质就只会在穿透液中。 下面传一张图片，AKTA的，你可以看A280曲线，穿透液里有很多蛋白质。  |
3楼2011-05-15 00:11:18
jia1012428
铜虫 (小有名气)
- BioEPI: 1
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 99.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 217
- 在线: 23.1小时
- 虫号: 577116
- 注册: 2008-06-22
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
4楼2011-05-15 22:52:41
投票:
