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jia1012428铜虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白纯化一个很挠头的问题，请高手指教！
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1.用离子交换柱做纯化，上样后洗脱未被柱子结合的蛋白，总能洗下来一个尖峰，而在拉Nacl溶液梯度的时候，也能洗脱下的几个峰，但这些峰都没有酶活。 2.后来增大了上样量，还是这种情况，只不过每个峰都高和宽一些，更重要的是，在洗脱未被结合的蛋白的峰那里测到了酶活。 请问我的这种情况是不是书上说的柱子只结合杂蛋白，而不结合目的蛋白？ 另外，1中测不到目的峰的酶活是不是因为蛋白太稀了，酶活检测不到；2中洗脱未结合的目的峰有发酵液色素的颜色，是不是上样量太大了，都没吸附到柱子上啊，所以才有酶活？ 请高手指点！ |
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2楼2011-05-15 00:09:51
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【答案】应助回帖
jia1012428(金币+2): 专业，不用再说明！ 2011-05-15 23:11:13
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:40:04
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:40:04
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你想要的蛋白质等电点可能是多少，上样缓冲液的pH值是多少？如果是阳离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值高；如果是阴离子柱，那么蛋白质等电点要比上样缓冲液的pH值低。而且要有一个pH值的差别才好吸附。 无论是阴还是阳，吸附的时候都要保持低盐，如果蛋白质等电点和上样缓冲液的pH值相差不大，那么一点儿盐就能解吸附，你要的蛋白质就只会在穿透液中。 下面传一张图片，AKTA的，你可以看A280曲线，穿透液里有很多蛋白质。  |
3楼2011-05-15 00:11:18
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5): 鼓励交流 2011-05-16 08:40:18
silicare(金币+5): 鼓励交流 2011-05-16 08:40:18
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1、你用了阴离子柱，确实是在纯化蛋白质，毫无置疑。 2、我的柱床体积也是20毫升，但这跟穿透液有没有酶活力没有关系。 3、你第一次上样时候穿透液的蛋白质峰达到550mau，第二次达到1400mau，是第一次的两倍多；第一次三次不连续梯度洗脱中最高峰为350mau，第二次为500mau。确实是上样量加大了。 4、总有些色素是不会被层析柱吸附的，也总有一些是被吸附的，这与色素的性质有关，与层析柱的吸附能力无关。 5、细碎线为电导率，最终的电导率约为85%，是不是用1M的氯化钠？两次穿透液中都有5-7%的电导率，说明你除盐除得不够干净，又或者你用来除盐的溶液本身的电导率就较大，所以很多蛋白质都不被吸附，建议你除盐干净一些，这样的要的蛋白质可能就能吸附了。 6、如果还不能吸附，那么可能是你的蛋白质等电点与起始缓冲液的pH值差不多，就要改变起始缓冲液的pH值。 |
6楼2011-05-16 00:09:24
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8楼2011-05-16 16:27:10
