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majunyang

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化-过DEAE阴离子交换柱

最近在做蛋白质的分离纯化，硫酸铵沉淀后过DEAE阴离子交换柱，测酶活可知目的蛋白的出峰电导，但是跑SDS-PAGE确不能判断目的蛋白条带，怎么办呢。
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.。。。。。。。。。。。
1楼 2012-07-26 20:20:00
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-28 08:38:38
1. 建议接前峰， 峰尖，和后峰，各200uL，加电泳Buffer处理后，做SDS-PAGE。

2.你的情况也可能是有酶活，但是蛋白浓度太低，SDS-PAGE检测不到。
SDS-PAGE 我觉得20~50 mg/L的蛋白都能检测到啊。
这种情况你需要浓缩穿出液了。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
2楼2012-07-27 08:09:59
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HarveyWang

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海外行者
引用回帖:
2楼: Originally posted by HarveyWang at 2012-07-27 08:09:59
1. 建议接前峰， 峰尖，和后峰，各200uL，加电泳Buffer处理后，做SDS-PAGE。

2.你的情况也可能是有酶活，但是蛋白浓度太低，SDS-PAGE检测不到。
SDS-PAGE 我觉得20~50 mg/L的蛋白都能检测到啊。
这种情况你需 ...

我觉得你不应该是接 电导出峰，而是蛋白吸收出峰才对，就是接280nm的峰啊。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
3楼2012-07-27 08:11:35
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by HarveyWang at 2012-07-27 08:11:35
我觉得你不应该是接 电导出峰，而是蛋白吸收出峰才对，就是接280nm的峰啊。...

恩 我是接280nm的峰，已经确定出峰时的电导，就是条带不能确定。收集200uL，要收集这么少，我收集时都是每管收集2mL,整个峰都收集下来，是不是每管有点多了，以致浓度太低了。浓缩的话用什么方法比较好啊。
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.。。。。。。。。。。。
4楼2012-07-27 10:57:16
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by majunyang at 2012-07-27 10:57:16
恩 我是接280nm的峰，已经确定出峰时的电导，就是条带不能确定。收集200uL，要收集这么少，我收集时都是每管收集2mL,整个峰都收集下来，是不是每管有点多了，以致浓度太低了。浓缩的话用什么方法比较好啊。...

对，收集整个峰，会极大地稀释蛋白浓度的。
因为峰尖前后蛋白浓度会较低。
所以，应该收集峰尖走电泳嘛

浓缩，主要是用三氯乙酸沉淀（最终工作浓度是5%左右），离心，然后洗涤，加适量电泳buffer煮。。。5mL都可以浓缩成200uL
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
5楼2012-07-27 12:57:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
依据蛋白质条带和酶活力的强弱变化推断
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2012-07-28 00:01:37
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li1991511

新虫 (初入文坛)
你们直接就过DEAE柱吗 我们都是先过一个G-25柱 脱盐   过DEAE接样时 我们都连接一个HD-9707紫外检测仪 在线监测 然后子根据实际情况 根据示数接样 那样接的样 纯度 浓度 都能高点
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这一年，异乡飘雪的日子。。。。。
7楼2013-08-24 12:44:05
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你收集的峰蛋白浓度太低了，应该浓缩后进行电泳。建议用超滤浓缩
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8楼2013-11-19 23:13:46
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